晶状体上皮细胞TGF-β/Smad信号转导通路的研究

【摘要】：目的：后囊膜混浊(Posterior capsule opacification, PCO)是白内障术后引起视力下降的常见并发症。晶状体上皮细胞TGF-β/Smad信号转导途径得到越来越多的关注。本文采用RNA干扰技术,分别阻断TGF-β2/Smad2、TGF-β2/Smad3和TGF-β2/Smad23信号转导通路。研究目的是构建Smad2和Smad3 siRNA的表达质粒,以HLEβ-3细胞为研究对象,探讨TGF-β2/Smad2和TGF-β2/Smad3信号传导途径分别对于HLE B-3细胞增殖、迁移和细胞外基质产生的调节作用,评价其在后囊膜混浊发生中的作用。 方法：本研究包括两部分：1.分别设计人晶状体上皮细胞的siRNA,以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建Smad2和Smad3的siRNA表达质粒,转化大肠杆菌,酶切、测序进行鉴定。2.体外培养HLE B-3细胞,利用siRNA分别阻断Smad2, Smad3, Smad2和3信号传导途径。通过MTT和细胞生长曲线实验评价细胞增殖,通过transwell和划痕实验评价细胞迁移,通过real-time PCR评价aSMA、纤维素和Ⅰ型胶原的表达。 结果：1.合成的DNA序列退火后克隆到pSilencer2.1-U6neo质粒载体上,进行酶切、测序分析,确定为所需序列。2.阻断Smad2组MTT实验570nm光吸收值和细胞生长曲线细胞计数TGF-β2组明显低于对照组(P0.05),纤维素和Ⅰ型胶原表达TGF-β2组明显高于对照组(P0.05), aSMA表达、划痕实验细胞迁移距离和transwell迁移细胞数TGF-β2组与对照组没有显著性差异(P0.05);阻断Smad3组aSMA表达,划痕实验细胞迁移距离和transwell迁移细胞数明显高于对照组(P0.05), MTT实验570nm光吸收值,细胞生长曲线细胞计数,纤维素和Ⅰ型胶原表达TGF-β2组与对照组没有显著性差异(P0.05)。同时阻断Smad2和Smad3组,MTT实验570nm光吸收值和细胞生长曲线细胞计数,aSMA、纤维素和Ⅰ型胶原表达,划痕实验细胞迁移距离和transwell迁移细胞数TGF-β2组与对照组没有显著性差异(P0.05)。 结论：1. Smad2和Smad3 siRNA表达质粒能有效阻断TGF-β2/Smad2、TGF-β2/Smad3和TGF-β2/Smad23信号转导通路,及Smad2和Smad3mRNA和蛋白的表达。2. Smad3可以阻断TGF-β2对于细胞增殖和ECM产生的调节,阻断Smad2可以阻断TGF-β2对于细胞迁移和aSMA产生的调节。3. Smad2耗竭可以加强Smad3的活性,Smad3耗竭可以加强Smad2的活性。4.只有阻断Smad2和Smad3信号转导通路,才可以有效阻断TGF-β2在晶状体上皮细胞增殖、迁移和ECM产生的调节作用。从而有效阻断PCO的形成。