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荧光定量PCR检测肝癌相关基因表达并建立分子诊断指数

余俊  
【摘要】:肝细胞癌(HCC)恶性度高,预后差,早期诊断可改善患者预后。血清AFP敏感性低,诊断肝癌易造成漏诊。随着分子生物学的飞速发展,越来越多的肝癌血清标志物被报道,单一肝癌血清标志物的敏感性和特异性很难突破AFP的水平。多肿瘤标志物联合诊断可以有效提高肝癌的诊断率。本实验室前期应用荧光定量PCR检测肝脏组织中16个肝癌相关基因表达,从中优选出6个肝癌高度相关基因并建立分子诊断指数,提高了肝癌诊断的敏感性及特异性。 研究目的:筛选特异性好、表达水平高的肝细胞癌相关基因,进一步优化基因组合,建立肝癌分子诊断指数,验证其在肝癌诊断中的价值。 研究方法:从本实验室建立的HCC高/低表达基因cDNA文库和国内外文献中筛选抑癌基因4个PRDM2、IGFBP3、DLC1、WWOX)和癌基因9个(GPC3、STMN、CCNA2、UBD、CD133、BIRC5、AFP、E2F1、GMNN),合计13个基因。选择60例手术切除组织标本,其中10例正常肝、10例肝硬化、40例癌和配对癌旁及手术切缘组织,提取总mRNA后逆转录cDNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)检测此13个基因在正常肝、肝硬化、肝癌组织中的表达,以管家基因G3PDH为对照,2-△△cT法计算肝癌相关基因相对表达量,各组织与正常肝组织相比,2-△△CT值相差3倍认为该基因在该组织中存在异常表达。最终从13个备选基因中挑选出与肝癌相关程度高且与正常肝、肝硬化组织表达差异大的基因,依据这些基因在组织中异常表达的个数建立分子诊断指数,用ROC曲线初步评估其在HCC诊断中的价值。 研究结果:13个备选基因中荧光定量PCR扩增效果好的基因共有11个。在40例癌组织中,抑癌基因PRDM2、IGFBP3、DLC1分别有65.0%、75.0%、67.5%的标本表达小于3倍正常肝组织,癌基因GPC3、STMN、CCNA2、BIRC5、AFP分别有87.5%、77.5%、82.5%、85.0%、67.5%的标本表达大于3倍正常肝组织,并且与肝硬化组织表达差异显著(各基因表达量中位数之比,0.19 vs 0.57;0.09vs O.53; 0.12 vs 0.42; 191.08 vs 3.30; 9.96 vs 0.96; 20.03 vs 1.58; 13.21 vs 1.45;24.20 vs 0.83;均P0.05)。而WWOX只有30.0%的标本呈3倍量下调,CD133只有10.0%的标本呈3倍量上调;UBD有90.0%的标本呈3倍量上调,但亦有70.0%的肝硬化标本呈3倍量上调,特异性差;最终选取PRDM2、IGFBP3、DLC1、GPC3、STMN、CCNA2、BIRC5、AFP此8个基因作为肝癌高度相关基因。依据各基因的荧光定量相对值做散点图,抑癌基因PRDM2、IGFBP3、DLC1从正常肝、肝硬化到癌组表达呈明显递减趋势,癌基因GPC3、STMN、CCNA2、BIRC5、AFP从正常肝、肝硬化到癌组表达呈明显递增趋势。以此8个基因建立分子诊断指数,其在肝硬化、手术切缘、癌旁2 cm、癌组中分别为2.2±1.5、3.0±1.6、2.9±1.5、6.3±1.2,癌组与肝硬化组、切缘组、癌旁2 cm组差异显著。以肝硬化组作为对照组,当分子诊断指数大于等于3.5诊断为肝癌时,ROC曲线的敏感性为100%,特异性为90%,准确度为98%,AUC为0.995。分别以癌旁2cm组、手术切缘组为对照组,当分子诊断指数大于等于4.5诊断为肝癌时,ROC曲线的敏感性均为90%,特异性分别为81%、79%,准确度分别为91%、90%,AUC分别为0.952、0.946。在40例癌标本中,诊断指数从4到8,如将诊断指数7、8列为高诊断指数组(共15例样本),6、5、4列为低诊断指数组(共25例样本),对两组采用log-rank检验进行生存分析并绘制Kaplan-Meier生存曲线,结果低诊断指数组比高诊断指数组生存曲线高、下降平缓,两条曲线差异具有统计学意义,P=0.04,提示低诊断指数组预后较好。 研究结论:荧光定量PCR检测肝癌相关基因在正常肝、肝硬化、手术切缘、癌旁2 cm及癌组织中的相对表达量,结果表明GPC3等8个基因在癌组织与其他各组织之间表达存在明显差异(均P0.05),并且在癌组织中各基因的表达量亦有差别,说明基因改变存在于肝癌中且与肿瘤生长特性相关。优选PRDM2、IGFBP3、DLC1、GPC3、STM、CCNA2、BIRC5、AFP基因成功建立了分子诊断指数,应用ROC曲线对40例肝癌标本和其它标本进行分析,结果显示分子诊断指数在肝癌诊断中具有较高的准确度,能有效的鉴别癌组织与良性肝脏组织(肝硬化组织、癌旁硬化组织及手术切缘组织)。进一步将分子诊断指数用于患者的预后评估,具有低诊断指数的患者生存时间较长、预后较好。本实验证实了分子诊断指数在肝癌诊断中的价值,为下一步在血清中建立诊断指数提供了方法学及依据,使分子诊断指数能更好的应用于临床。


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