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人IL-21基因联合γ射线照射对子宫颈癌Hela细胞抑制作用的研究

邵盈  
【摘要】:目的 恶性肿瘤严重威胁着人类的健康与生命,肿瘤治疗是目前医学研究的重点,其治疗方法包括传统的放疗、化疗、手术以及基因治疗等。放射治疗是中晚期宫颈癌中选治疗方法,并疗效肯定。但与肿瘤临近部位的正常组织放射损伤和某些肿瘤的辐射抗拒性等问题,影响着放疗的疗效和应用。因此,如何降低或消除其不良反应,增强放疗效果一直是放射肿瘤学研究的重要课题。放疗和基因治疗两者之间存在着相互增强的作用。增强的机理是射线照射后增加基因转染的效率和(或)促进基因的表达,另外基因转染后可增加肿瘤细胞对射线照射的敏感性。IL-21是近年来发现的一种细胞因子,Parrish-Njovak等研究者克隆了白介素21(IL-21)及其受体(IL-21R)的cDNA。人IL-21 cDNA的ORF编码162aa多肽前体,其信号肽31aa,成熟蛋白131aa,推算其分子量15kD。IL-21具有与IL-2、IL-4和IL-15高度同源的细胞因子4螺旋束结构域。IL-21和IL-15的两对Cys残基所处的位置相同,其中一对Cys残基所处位置也与IL-2、IL-15和GM-CSF相同,另一对Cys残基则是IL-21和IL-15独有的。人IL-21(hIL-21)基因定位在4q26-q27上,约距IL-2基因1180kb,距离IL-15基因更远。本实验目的是通过含有IL-21基因的重组腺病毒载体(Ad-IL-21)转染体外培养的人宫颈癌细胞系Hela,观察IL-21基因的抑瘤效应,然后联合Υ射线照射,研究两者的协同抑瘤作用,为临床宫颈癌的其因治疗和放射治疗的联合应用提供实验依据。 方法 本实验将已构建好的重组腺病毒Ad-IL-21基因于体外转染宫颈癌Hela细胞,转染后进行6Gy(?)CsΥ射线照射,Ad-1acZ的病毒滴度为1.4×1012pfu/ml,重组腺病毒Ad-IL-21的病毒滴度为9×1011pfu/ml,感染率MOI值为100。实验分组设计为空白对照组、Ad-lacZ对照组、Ad-IL-21组、单独照射组和Ad-IL-21联合照射组。用MTT法和流式细胞术观察IL-21基因联合照射对细胞生长及细胞周期、凋亡的的影响。通过PCR及Western Blotting鉴定Ad-IL-21转染宫颈癌Hela细胞中的表达情况。 结果 1.宫颈癌Hela细胞生长曲线:空白对照组和Ad-lacZ组Hela细胞数量随培养时间延长呈增加的趋势,Ad-IL-21基因组于转染后96h肿瘤细胞出现明显的抑制作用,与空白对照组和Ad-lacZ组比较有差异统计学意义(F=7.181 P0.05),而空白对照组与Ad-lacZ组比较无明显差异(P0.05)。而单独照射组和Ad-IL-21基因联合照射组Hela细胞的于转染后48h出现较明显的抑制作用,联合照射组和单独照射组与Ad-lacZ组和Ad-IL-21基因组比较差异有统计学意义(F=249.88P0.05),尤其在转染后96h联合组与单独照射组和Ad-IL-21基因比较,细胞生长抑制作用明显(F=42.981 P0.05)。 2.宫颈癌Hela细胞周期和凋亡情况:流式细胞检测结果显示,与Ad-lacZ组和空白对照组相比,Ad-IL-21组、单独照射组Ad-IL-21联合照射组Hela细胞停留在G1期的细胞增加,S期细胞数量减少,凋亡率增加,其中以联合照射组G1期细胞细胞所占比例最高,达到88.9%凋亡率15.3%,比Ad-lacZ组增加15.8%,S期细胞最少,1%,凋亡率增加了11.1% 3.宫颈癌Hela细胞内IL-21基因表达的变化:Ad-IL-21转染Hela细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增出预计的IL-21基因片段(493bp),以GAPDH为对照(300bp)。经Quantity one(?)软件进行灰度分析,空白对照组、Ad-IL-21基因组、Ad-IL-21基因联合照射组的IL-21基因相对表达量分别为0.17、0.35、0.38.Ad-IL-21组Hela细胞中IL-21基因表达量比空白对照组高,联合照射组IL-21基因表达量最多,分别是Ad-IL-21组和空白对照组的1.1倍和2.24倍。 4.宫颈癌Hela细胞内IL-21基因蛋白农达的变化:Ad-IL-21转染Hela细胞后提取总蛋白,Western bloting(?)检测发现IL-21基因蛋白的特异性条带出现在Marker标准相对分子量15KD左右,以内参β-actin为对照,出现在42KD左右。利用灰度分析软件Quantity one对蛋白印迹带进行分析:空白对照组、Ad-IL-21组、单独照射组及Ad-IL-21联合照射组IL-21的相对表达量为0.42、0.92、0.61和0.99。4个组均表达IL-21基因蛋白,Ad-IL-21联合照射组IL-21表达量最高,Ad-IL-21表达明显比空白对照组及单独照射组高。 结论 1.重组腺病毒Ad-IL-21能抑制宫颈癌Hela细胞的生长,通过与Ad-IacZ对照比较,表明对肿瘤细胞的抑制作用来自转导的IL-21基因,而不是腺病毒载体本身。 2.Ad-IL-21组、单独照射组及Ad-IL-21联合照射组对Hela细胞生长均有抑制作用,联合治疗组具有协同作用,其抑制效应最强,单独照射组与Ad-IL-21组抑制效应相当。Ad-IL-21组、单独照射组及Ad-IL-21联合照射组滞宫颈癌Hela细胞周期于G1期,使细胞对射线更敏感,促进细胞凋亡,联合治疗组凋亡率最高,有效地抑制肿瘤细胞的生长。 3.经RT-PCR及Western blotting检测发现,空白对照组、Ad-IL-21组、Ad-IL-21联合照射组中的IL-21基因及蛋白表达量不同,重组腺病毒Ad-IL-21有效地转染进入细胞,并且在细胞中稳定表达,联合治疗组的IL-21基因及蛋白表达量最高,结果说明单独IL-21基因对宫颈癌Hela细胞的生长具有一定的抑制作用,而Ad-IL-21联合照射组抑瘤效应最明显,有效地抑制肿瘤细胞的生长,为今后用于临床恶性肿瘤的治疗提供了一个新的治疗方案。


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