卵母细胞体外成熟培养的研究

【摘要】： 研究背景：近20年来，辅助生育技术有了突飞猛进的发展，体外受精、卵浆内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSl)和种植前遗传学诊断技术的成熟标志着人类生殖医学进入了崭新的领域，但同时也不能否认，在这一领域中还存在诸如妊娠率低、药物副作用和多胎率高等问题。在助孕技术中普遍应用的卵巢促排卵方案，虽然可以使获卵率提高，但在临床上也暴露出一些问题，如卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)的发生、治疗费用高以及与远期发生卵巢癌的可能关系等等，已引起人们的关注。卵母细胞体外成熟培养技术(in vitro maturation,IVM)是近年来研究的热点，它是在自然周期或使用少量促性腺激素的周期，将不成熟的卵母细胞在体外培养成熟，进行体外受精和胚胎移植，它克服了促排卵药物的副作用，是今后助孕技术发展的趋势之卵母细胞的成熟包括细胞核成熟和细胞浆成熟两部分，其中第一极体的释放提示细胞核成熟的完成，而对细胞浆成熟的评价是在体外受精后通过受精和卵裂情况完成的。虽然未成熟卵经体外培养后细胞核成熟的比例在60％～70％，但是受精率低，胚胎发育阻滞率高，囊胚形成率低，这提示体外成熟的卵母细胞存在着细胞浆成熟欠缺或核浆成熟不协调的问题，这是制约IVM技术广泛应用的主要障碍。所以，继续深入认识卵母细胞的成熟规律和改善体外成熟培养环境是当前的主要方向。 卵母细胞在体内的成热过程是在促性腺激素的作用下在卵泡内完成的。卵泡是一个结构和功能单位，其中颗粒细胞是卵泡内主要的体细胞成分，它介导促性腺激素对卵母细胞的调节，同时通过自分泌或旁分泌作用，维持有利于卵母细胞成熟的微环境。在成熟培养体系中引入颗粒细胞的生长液能否促进卵母细胞的完全成熟，尚未见研究报道。 天津医科大学博士学位论文 皮质颗粒＊ ranule，CG）是大多数哺乳动物卵母细胞所特有的 一种细胞器，在卵母细胞的成熟过程中出现特征性的位置迁移，皮质颗粒向 胞膜下迁移，沿卵膜下呈线状排列，这是目前公认的哺乳动物卵母细胞成熟 最后阶段的一个共同特征。卵母细胞在成熟和受精过程中，细胞骨架发生一 系列明显的变化，微管是一种重要的细胞骨架成分，对于哺乳动物卵母细胞 减数分裂的完成、精子的运动、雌雄原核的结合是必不可少的。在卵母细胞 体外成熟过程中，皮质颗粒和微管是否发生与细胞核成熟同步的变化，关系 到卵母细胞成熟后受精及卵裂的能力。目前研究体外成熟卵的皮质颗粒和微 管变化的文献所见不多。 本研究分为两部分，第一部分主要在卵巢颗粒细胞原代培养的基础上， 研究颗粒细胞的分泌功能以及FSH、GnRHa对分泌功能的影响，其中颗粒 细胞的纯度鉴定、颗粒细胞分泌IGFl和EGF以及GnRHa对颗粒细胞功能 影啊的研究尚未见报道。第二部分研究颗粒细胞生长液等对卵母细胞体外成 熟以及进一步发育潜能的影响，其中在IVM培养体系中加入颗粒细胞生长 液尚未见文献报道。 研究目的：1．研究成熟卵泡内的微环境；2．研究卵巢颗粒细胞的功能和 调控；3．研究卯巢颗粒细胞主长液、表皮生长因子（ePidermal grot4th factor，EG＊）和胰岛素样主长因于 1（insulinAke gTotVth factor，IGF l） 对卵母细胞体外成熟和发育潜能的影响；4．以庆质颗粒和微管的特征性 分布研究不同的培养体系和培养时间对卵母细胞核浆成熟协调性的影响。 研究方法：1．利用放免法检测13例接受体外受精患者卵泡液的雌二醇 Estradlol，E，）、孕酮（Progesterone，P ）和睾酮（Testosterone，T）的水 平，利用免放法检测 IGF，利用 ELISA捡测 EGF 2．对 16例接受体外受 精患者卵泡液中分离的卵巢颗粒细胞进行体外培养，利用免疫组化法和RT－ PCR法检测颗粒细胞的 FSHR的蛋白表达和 mRNA的表达，鉴定体外培养 颗粒细胞的纯度；3．研究 FSH （75ml／ml）和 GnRHa l 00pg／ml）对体外 －4－ 天津医科大学博士学位论文 培养颗粒细胞分泌EZ、P、T、EGF和IGF刁的影响；4．使用3种体外成熟 培养体系：对照组（FSH 75mIUml＋Ez InM）、生长因子组（FSH 75mIU／ml＋ E。InM EGF lug／ml十 IGF－110ng／ml）和颗粒细胞生长液组 乃0％颗粒细胞生长液），对昆明白小鼠生发泡期（ge讪nal vesicle，GV） 卵母细胞进行体外成熟培养；5．通过体外受精观察比较各组体外成熟卵细胞 的受精率、卵裂率和囊胚形成率：6．利用直接免疫荧光染色和共聚焦显微镜 （confocal scan－mug laser microscopy，CSLM），研究各