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大豆异黄酮对体外血管内皮细胞氧化损伤保护作用的研究

刘英华  
【摘要】: 目的 本研究采用氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)损伤,建立VEC氧化损伤模型,观察大豆异黄酮(soybean isoflavone,SI)对氧化损伤VEC的保护作用,并探讨其机制,为研究SI预防动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的发生提供科学依据。 方法 1.体外VEC氧化损伤模型的建立:体外培养人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vascular endothelial Cells,HUVEC),用Cu~(2+)引发LDL脂质过氧化,产生的ox-LDL诱导HUVEC损伤,24h后收集细胞。实验分空白对照组(control)、ox-LDL 1~6组(MDA含量分别为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5nmol/ml),测定各组细胞胞浆蛋白含量、四唑盐(MTT)指标及control组、ox-LDL 3、4、5组细胞丙二醛(MDA)含量,并观察各组细胞形态变化。2.SI对体外VEC氧化损伤保护作用的研究:(1)SI对正常VEC的直接作用实验:实验分control组、SI不同浓度组(SI浓度分别为5、10、25、50、100、200μmol/L)。将不同浓度SI与生长融合成单层的VEC共同孵育24h,收集细胞,测定各组细胞MDA含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。(2)SI与不加细胞LDL、ox-LDL的体外孵育实验:①SI对LDL的氧化抑制作用:实验分非氧化LDL组(N-LDL)及(Cu~(2+)+LDL)与不同浓度SI(SI浓度分别为0、5、10、25、50、100、200μmol/L)共同作用组,作用时间为24h。每隔4h测定各组样品的蛋白及MDA含量。②SI对ox-LDL的逆转录作用:实验分N-LDL组及ox-LDL与不同浓度SI(SI浓度分别为0、5、10、25、50、100、200μmol/L)共同作用组,作用时间为24h。测定各组样品的蛋白及MDA含量。(3)SI对VEC氧化损伤的保护作用:实验分control组、氧化损伤对照组(ox-LDL,其MDA含量为1.0nmol/ml)、氧化损伤加入维生素E对照组(VE+ox-LDL,VE浓度为50μmol/L)、氧化损伤加入SI低、中、高浓度组(SI-L+ox-LDL、SI-M+ox-LDL、SI-H+ox-LDL;SI浓度分别为10、50、100μmol/L)。取融合生长为单层的细胞,按剂量分组加入VE、SI预孵24h,再与除菌后的ox-LDL继续培养24h,收集细胞,测定各组细胞活力及抗氧化指标,检验各组单核细胞-内皮细胞 天草医群才笋砰法笋夕触戈 中文摘要 (MC一EC)粘附率,计算各组细胞凋亡指数(AI),并对各组细胞进行光镜、 电镜的形态学观察。 结果1.体外俄氧化损伤模型的建立:ox一LDLI、2、3组与control 组组间两两比较,胞浆蛋白含量、MTT(OD)指标,无显著性差异(P0.05), 且四组细胞形态相似:ox一LDL4、5、6组与control组组间两两比较,胞浆 蛋白含量、MTT(OD)均有显著性差异(P0. 01),且依次明显降低,ox一LDL4 组(MDA含量为1 .onmol/ml)细胞变形,但细胞边界尚清楚,而ox一LDLS、 6组细胞变形明显,胞膜边缘不清晰,有较多细胞脱落。另外,ox一LDL3组 与Control组比较,细胞MDA含量无显著性差异‘(P0.05),而ox一LDL4、5 组细胞MDA含量均明显高于control组(P0 .01),且依次升高。2.51对体 外兜C氧化损伤保护作用的研究:(l)SI对正常VEC的直接作用实验结果显 示:10~200 p mol/LSI可使细胞MDA含量和SOD活性不同程度的降低或升 高,差异有显著性(P0.01);但是对GSH一Px活性无影响,差异无显著性 (P0.05)。(2)SI与不加细胞LDL、ox一LDL的体外孵育实验结果显示:①SI 对LDL的氧化抑制作用:在8h~24h各时间段组,SI各浓度组MDA含量均 明显低于,ox一LDL组,差异有显著性(P0.01)。②SI对ox一LDL的逆转录作 用:S工各浓度组与ox一LDL组组间两两比较,MDA含量无显著性差异(P0.05), 且均高于N一LDL组(P(0.01)。(3)51对VEC氧化损伤的保护作用:eontrol、 vE+ox一LDL及(51一L、M、H)+ox一LDL组分别与ox一LDL组比较,细胞胞浆蛋 白含量、MTT(OD)、SOD活性、GSH一PX活性及一氧化氮(NO)含量均显著升 高,差异有显著性(P0.01),MDA含量、乳酸脱氢酶(LDH)释放百分比、 MC一EC粘附率及AI均显著降低,差异有显著性(P0.01),且由细胞计数计 算的细胞存活率远远高于ox一LDL组,而由MTT(OD)计算的细胞抑制率(IR) 远远低于ox一LDL组。此外,51一M+ox一LDL组与VE+ox一LDL组比较,各指标均 无显著性差异(P0 .05)。倒置相差显微镜观察vEC,ox一LDL组细胞变形,细 胞间隙增大;S工一L十。x一LDL组与ox一LDL组比较,细胞形态无明显改善,但细 胞间隙缩小,细胞间连接增加;(SI一M、H)+ox一LDL组与ox一LDL组比较,细 胞形态明显好转,细胞形态基本恢复正常,而VE+ox一LDL组细胞形态与 51一M+ox一LDL组相似。扫描电镜观察VEC,可见。ontrol组细胞呈多边形,表 面微绒毛丰富;而ox一LDL组细胞明显变形,表面微绒毛减少甚至消失; S工一M十。x一LDL组细胞胞膜表面均匀散布着短小的微绒毛;VE+ox一LDL组与 天单医澎才笋砰毖笋夕绘戈 中文摘要 S卜M+。x一LDL组细胞形态相似。 浩恰1.ox一LDL可诱导VEC损伤,且其内MDA含量不同,对VEC的损 伤程度不同。ox一LDL中MDA含量为1 .onmol/ml时为适合实验研究的损伤浓 度。2.51可增强VEC自身抗氧化能力,可


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