胃癌及其癌前病变肿瘤相关基因的克隆和鉴定

【摘要】：背景和目的：在我国，胃癌仍是肿瘤性死亡的首要原因。胃癌的发病经历慢性萎缩胃炎、肠化生、不典型增生到胃癌的过程。慢性萎缩胃炎、肠化生和不典型增生是公认的胃癌前病变，也是胃癌研究的难点。如何对癌前病变进行监测并及早进行治疗，一直是提高胃癌防治水平的重要环节。随着分子生物学的发展和人类基因组计划的深入研究，致病基因的克隆与鉴定受到了广泛的重视。mRNA差异显示技术是目前克隆疾病相关基因十分常用的方法，特别是在肿瘤相关基因的研究工作中，获得了广泛的应用。应用差异显示方法筛选胃癌及其癌前病变相关的特异性基因，从分子水平认识这一发展过程的微细转化规律，可以在肿瘤发生之前及早提示胃癌发生的危险及发展趋势，及早进行治疗，对于提高胃癌的诊治水平具有重要的意义。 材料和方法： 1．差异条带的筛选和分离：应用荧光mRNA差异显示方法筛选并分离胃癌、癌前病变及正常胃黏膜组织之间差异表达的cDNA条带，切胶并获取差异条带，进行PCR再扩增。 2．差异条带的克隆和序列分析：将cDNA片段与质粒连接，经蓝白斑筛选，克隆差异条带。提取质粒后，EcoR Ⅰ酶切鉴定克隆的cDNA片段。应用末端双脱氧法进行DNA序列测定。在互联上网上将测序结果提交GenBank数据库，经BLASTN软件检索，进行同源性对比分析，获取cDNA片段与GenBank数据库库已知基因序列的比对结果。将未找到高度同源序列的cDNA片段序列提交 天津医科大学博士学位论文 GenBank数据库，获取新的表达序列标签登录号。 3.验证和检测基因在组织中的表达:提取胃癌、癌前病变和正常胃豁膜组织 的总RNA，以cDNA片段为模版制备地高辛标记的cRNA荧光探针，进行 Norther:印迹杂交，验证CDNA片段在3种组织中的表达。将三种组织的总 R叭逆转录为cDNA，依据基因片段序列合成上、下游引物，以合成引物进行 PC尺扩增。采用凝胶成像分析系统，以目的基因与内参照(日一aC t in)积分 吸光度的比值，进行半定量的表达水平的检测。 4.基因全长序列的获得及分析:应用5‘末端快速扩增法(raPid amp 1 1 f 1 Cation of eDNA end，RACE)扩增一个新基因片段的全长序列。依 据基因片段的已知序列合成基因特异性引物(GSP)，以基因表达的全长mRNA 为模版逆转录合成CDNA，以CDNA为模版，应用GSP和通用引物(universal primer a mix，UpM)为上、下游引物进行PCR扩增，获得延伸的新基因片 段。克隆基因并测序，确定新基因全长序列。通过NCBI网站ORF finder软 件和Bioedit软件确定完整的开放阅读框架(。pen reading frame，ORF)， Map V iew软件确定其染色体定位。用基因表达系列分析数据库(Series an七，iysiS Of gene express，SAGE)检测其组织分布以及RT一PeR检测在其它 组织中的表达。应用Bioedit软件和互联网上蛋白数据库软件分析蛋白序列 基本特性、酶切位点、亚细胞定位、功能位点以及二级结构预测。 结果:切胶分离了30个差异表达的CDNA条带，经过筛选和PCR再扩增， 获得12个差异表达的cDNA条带。经同源性比较发现，4个基因片段在GenBank 数据库中未找到高度同源的序列，在GenBank获得了新的EST登录号。其余 8个基因片段均发现有与之高度同源的已知基因序列。其中，一个基因片段 与血影蛋白基因高度同源，一个与CDg基因高度同源。一个与核糖体蛋白524 基因高度同源，另外5个片段的同源序列基因的功能尚未确定。Northern印 迹杂交验证4个新的EST在三种组织中的表达规律与差异显示表达结果相一 致，半定量分析结果显示癌前组织中各基因表达水平介于正常与胃癌之间， 天津医科大学博士学位论文 说明胃癌相关基因的表达异常是经过癌前病变这一中间环节而逐步转化的。 半定量RT一PCR验证血影蛋白基因在胃癌组织中高表达，在胃癌、癌前病变到 正常组织，其表达水平呈现逐步减低的趋势。CDg基因在胃癌组织中表达明 显低于正常胃勃膜及癌前病变组织，癌前病变组织也较正常胃勃膜表达减低。 应用5’RACE方法获得大小849bp的条带，发现一个SOlbp的完整ORF，表 达166个氨基酸序列。染色体定位于染色体 3pZI，RT一PCR验证发现其在正常 食管及结肠豁膜中高表达，而在食管癌、结肠癌、肝癌以及正常肝组织中低 表达。SAGE分析显示在脑成神经管细胞瘤、乳腺正常间质组织、脑室管膜细 胞瘤有较高的表达。蛋白序列分析显示蛋白序列中丝氨酸、精氨酸含量最高， 蛋白亚细胞定位于细胞核与线粒体，未发现有跨膜区域、与磷酸丙糖脱氢酶 (GAPDH)具有310/0的同源性。二级结构分析属于混合性结构，为球形蛋白。 结论: 1.在国内、外首次应用差异显示方法研究胃癌前病变的差异表达基因。筛选 并分离出与胃癌发生、发展相关的一些差异表达基因片段，从分子水平揭 示由正常胃豁膜、癌前病变到胃癌发展中的转化规律。 2.通过克隆和测序首次发现4个新的基因表达片段，并在GenBank获得新 的EST登录号。发现8个与已知基因高度同源的基因片段，对进一步了解 这些基因的功能及其在胃癌及癌前病变发病中的作用均具有的重要意义。 3.通过Northern印迹杂交验证新基因片段表达，确定其表达规律。发现在