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大鼠骨髓基质细胞和神经干细胞共同培养及颅内移植的实验研究

林欣  
【摘要】:随着交通的发展,颅脑损伤的发病率正逐年增高,这种疾病对人类健康乃至生命的威胁使其愈来愈受到关注。但目前现有的治疗措施对许多患者还未取得理想的效果,因此任何促进脑损伤患者受损神经功能恢复仍是目前研究的重点。在这个方面神经干细胞和骨髓基质细胞的研究是近年来神经科学的热点课题,而且研究取得了一定的成绩,使我们点燃了新的希望。许多研究者希望通过对骨髓基质细胞和神经干细胞的相关研究以了解胚胎与成年阶段神经发育与再生的规律,利用骨髓基质细胞和神经干细胞的固有性质实现与细胞移植、基因转导有关的疾病治疗和康复。 神经干细胞概念的确立,对既往50年中有关神经系统的发育和神经再生的设想给予了充分的肯定。成体神经干细胞的发现提示脑组织自身修复功能的存在,脑损伤后内源性神经干细胞的激活有助于受损神经功能的恢复;另外外源性神经干细胞移植也可用于修复受损的神经功能。 但来源受限使得外源性神经干细胞不能得到广泛应用。随后发现骨髓基质细胞可分泌许多因子,可以刺激内源性神经干细胞的分化,而且至少有30篇文献报告可以自身分化成神经组织各种细胞。骨髓基质细胞可取自自体骨髓,避免了外源物质的进入,也避免了伦理学,法律方面的障碍,并可显著减少免疫抑制剂的应用。因此骨髓基质细胞满足种子细胞的基本要求,骨髓基质细胞移植治疗脑损伤将会对脑损伤治疗提供重要的帮助。 基于以上各点,MSCs和NSCs体外共培养时增殖与分化的实验研究、细胞融合的实验研究,将是干细胞移植研究的重点。骨髓基质细胞移植治疗脑损伤刺激内源性NSCs的分化也是干细胞治疗脑损伤的理论基础。 第一部分 MSCs和NSCs体外共培养时增殖与分化的实验研究 天津医科大学博士学位论文 探讨骨髓基质细胞和神经干细胞体外共培养时,骨髓基质细胞和神经干 细胞之间增殖和分化的影响,阐明神经干细胞自身修复的启动过程,骨髓基 质细胞转化成神经元的机理。为临床治疗脑损伤提供理论帮助。 方法 采用大鼠骨髓基质细胞和胎脑神经干细胞体外共同培养,培养液使用神 经细胞培养液,不使用血清,增殖组不铺胶,分化组铺胶。两种细胞接种的 比例按NSCs:MSCs为l:0、2:0、10:l、l:l、l:10、0:l的比例接 种,培养时间为3、7、14、28天。通过免疫细胞化学染色方法鉴别和计数 神经干细胞、神经元和胶质细胞的数量,并与神经干细胞和骨髓基质细胞单 独培养组相比较。 结果 骨髓基质细胞和神经干细胞共同培养可明显提高神经干细胞和骨髓基 质细胞分化为神经元的比例,但抑制神经干细胞细胞球增殖的数量。二者共 培养时可以促进神经元突触的生长和神经元的保持和增殖。 结论 (1)神经干细胞和骨髓基质细胞共培养,抑制神经干细胞球状生长; (2)神经干细胞和骨髓基质细胞共培养,促进神经干细胞分化; (3)神经千细胞和骨髓基质细胞共培养,神经干细胞促进骨髓基质细胞分 化成神经元; (4)二者共培养时可以促进神经元突触的生长; (5)二者共培养可以促进神经元的保持和增殖。 第二部分大鼠脑损伤后颅内移植MSCs促进内源性NSCs分化的研究 目的 天津医科大学博士学位论文 我们将大鼠MSCs立体定向移植入脑创伤大鼠创伤区周围,了解脑内内 源性神经干细胞的增殖和分化情况,以及对大鼠神经运动功能的影响。 方法 以自由落体打击法制作Wis枉江大鼠脑损伤模型。成年健康雄性Wis七庄大 鼠随机分为5组:第1组:正常对照组,n=8,不进行移植和损伤。第2组: 损伤对照组,于8,只进行损伤,不进行注射。第3组:假治疗组,n=8, 在大鼠伤后3天立体定向下局部注射生理盐水20 pl。第4组:对照组,n=8, 在大鼠伤后3天立体定向下局部注射标记了BrdU的BMSCsZO,1。第5组: 实验组,n二8,在大鼠伤后3天立体定向下局部注射未标记Brd’口的BMSCs20 协1。除第4组外,其他各组每天2次腹腔注射BrdU(每次BrdU SOmg/kg), 直到处死前2小时。每组大鼠随机分为2组(各4只),分别在伤后14和28 天处死。损伤后第14天和28天,按照神经运动功能评分,评价功能恢复情 况。在预定时间过麻醉处死大鼠,经心脏生理盐水灌注,固定脑标本。免疫 组化染色检测脑组织中BrdU标记细胞,以双标记染色检测脑中BrdU阳性细 胞和表达神经元、星形胶质细胞特异性蛋白NSE、G异J的情况。 结果 MSCs立体定向移植后,第14天和28天脑创伤大鼠神经功能评分同对 照组相比有一定改善。第14天时移植组第4组25.27士0.82,第5组26.0肚1.58, 而第2组为23.6几1.22,第3组为232叭158。第28天时移植组第4组 33.6社1.65,第5组34.0肚1.98,而第2组为28.17士1.37,第3组为29.43士1.74。 第1组正常对照组免疫组织化学检查脑组织内没有骨髓源细胞。第4组大鼠 MSCs移植后脑组织内有BrdU阳性细胞。第5组与2一3组的BrdU阳性细胞 数比较无显著差异。2一3组BrdU八叮SE阳性细胞数为1 .56士0.35,1 .65士0.44, 而第5组为3.78士1.25,统计分析有显著差异,2一3组无差异。 结论 天津医科大学博士学位论文 (1)M SCs立体定向?


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