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卵巢上皮性癌顺铂化疗耐药机制及逆转策略的研究

刘国艳  
【摘要】:目的:研究卵巢上皮性癌组织和细胞系中ERCC1、BRCA1、hMLH1、HSP27基因蛋白的表达与顺铂敏感性的关系;观察米非司酮在体内外增强顺铂对卵巢癌耐药细胞的抗癌作用并分析其作用机制以及探讨RNA干扰ERCC1基因后卵巢癌细胞顺铂敏感性的变化。 方法:应用免疫组化法检测58例卵巢癌组织中4种蛋白的表达情况并分析其与顺铂耐药的关系,应用RT-PCR方法检测4种基因mRNA在卵巢癌细胞ES-2、SKOV3、COC1、COC1/DDP中的表达并观察不同浓度的顺铂作用24小时后基因的变化;应用MTT法观察在卵巢癌顺铂耐药细胞COC1/DDP米非司酮对顺铂的增敏作用,并通过流式细胞技术和RT-PCR、western blot分析其发挥作用的机制,同时建立COC1/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,在体内观察米非司酮对顺铂的增敏作用;体外合成特异性双链小分子RNA,转染卵巢癌细胞ES-2、SKOV3、COC1/DDP,通过RNA干扰技术关闭ERCC1基因,通过RT-PCR、western blot和免疫细胞化学法分析RNA干扰效果,应用MTT法观察转染后细胞对顺铂敏感性的变化。 结果:1、卵巢癌组织中ERCC1、BRCA1、baMLH1和HSP27的阳性表达率分别为37.90%、32.8%、75.9%、58.6%,58例中化疗耐药者ERCC1、BRCA1蛋白的阳性表达率高于敏感者,(p<0.05) hMLH1、HSP27蛋白在化疗敏感和耐药者中的表达无差异(p>0.05)。 2、ERCC1基因mRNA在4种细胞中的表达与顺铂IC50值存在相关性(p<0.01),其它3种基因与IC50值无相关性(p>0.05)。小剂量顺铂(2.5μg/ml)作用可上调4种细胞ERCC1基因,大剂量导致该基因的下调;COC1/DDP较敏感细胞COC1的BRCA1基因水平升高,且在顺铂的作用下,2种细胞的 天津医科大学博士研究生学位论文摘要 BRCAI基因均上调;顺铂可诱导hNILHI低水平的细胞该基因的上调,后随 顺铂剂量的增加,hMLHI基因下调;在顺铂的作用下,ES一2、SKOv3细胞 的HSP27基因下调。 3、2.5,M、5.ooM、10.0拼M米非司酮可使eoCIODp细胞对顺铂的 敏感性分别增加1.16、1.95、5.78倍,DDP联合米非司酮作用使细胞凋亡率 增加,GO/GI期细胞所占比例增加,ERCCI、BRCAI、hNILHI、HSP27基 因mRNA水平下降。 4、COCI/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤的成瘤率为96%,米非司酮组、顺 铂组、米非司酮联合顺铂组的肿瘤抑制率分别为6.50%、22.53%、70.08%, 联合治疗组与对照组相比较有显著差异(p0.01),各组裸鼠体重无差异,肝 脏、’肾脏无病理学改变。 5、转染针对ERCCI基因的siRNA后24、48、72小时ES一2、SKOV3、 COCI/DDP细胞的ERCCI基因mRNA水平下调,蛋白水平亦降低,RNA干 扰ERCCI基因后3种细胞对顺铂的敏感性分别增加53.88、5.07、3.75倍。 结论:1、ERCCI、BRCAI蛋白在卵巢上皮癌组织中的表达与顺铂化疗敏 感性相关。hNILHI、HSP27蛋白的表达与顺铂化疗耐药无关。 2、在卵巢癌细胞系ES一2、SKOV3、COCI、COCI/DDP,ERCCI基因 mRNA水平与顺铂敏感性相关,低剂量顺铂可诱导ERCCI基因的上调。不 同的细胞系顺铂对BRCAI、hNILHI、HSP27基因的调节作用不同。 3、米非司酮在体内外可增加顺铂对卵巢癌耐药细饱COCI/D DP的抗癌 作用。米非司酮无明显的毒副作用。 4、RNA干扰E RCCI基因可增强卵巢癌细胞ES一2、SKOV3、和 COC lzDDP对顺铂的敏感性。


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