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GFP基因标记的移植瘤活体分子成像研究

申宝忠  
【摘要】:目的 1、建立荷绿色荧光蛋白GFP(green fluorescent protein)基因标记的小鼠Lewis肺癌(LLC)移植瘤小鼠模型,实现活体、无创、实时和动态地观察研究肿瘤的生长、转移、肿瘤血管生成及治疗效果。2、利用以上模型和荧光分子成像技术,观察内皮抑素对小鼠LLC移植瘤的抑瘤作用,及对血管内皮生长因子(VEGF)和Bc1-2蛋白表达的影响。材料与方法1、在体外将pLEIN-CMV-GFP逆转录病毒载体质粒转入PT67包装细胞,测定病毒滴度,利用逆转录病毒载体pLEIN将GFP报告基因转染入小鼠LLC肿瘤细胞。使GFP在体外稳定表达后用G418筛选,收集转染成功并GFP高效表达的LLC肿瘤细胞。2、取0.2ml/2×10~6个/ml的细胞悬液种植于裸鼠背部皮下,使之生长形成移植瘤。在不同时间对裸鼠活体成像,摸索出成像的最佳条件,观察移植瘤的生长、转移及局部血管生成情况。3、选取15只雄性裸鼠,将肿瘤接种于裸鼠背部皮下。当移植瘤体积生长至400.600mm~3时分组并开始给药。实验小鼠随机分为三组,A组为空白对照组,B组每日局部注射内皮抑素20μg,C组每日局部注射环 天津医科大学博士研究生学位论文 磷酞胺(cTx)1 omg/kg,作为阳性对照,共11天。采用活体荧光成像 测定抑瘤率及并测定微血管密度的方法评价治疗效果,免疫组化(S一P) 法测定VEGF和Bcl一2在各组的表达水平。结果1、经体外G418筛选, 可以获得GFP基因稳定高效表达的肿瘤转染细胞,将该细胞在小鼠背 部接种并形成移植瘤模型;可通过荧光活体成像仪观察:活体内肿瘤早 期的生长变化及肿瘤血管的新生和发展情况,病理学证实发光组织与肿 瘤组织一致。2、试验组较空白对照组抑瘤率增高(P0.05),与CTX 组无显著差异;试验组微血管密度较空白对照组降低,VEGF和Bcl一2 水平较对照组低(P0.01),试验组微血管密度及vEGF和Bcl一2水平较 CTX组降低(P0.05),肿瘤荧光成像见肿瘤大部发出绿色荧光,发光 部位随肿瘤大小的改变而改变,不随肿瘤生长时间减弱。结论1、 该模型稳定可靠,GFP基因在小鼠LLC移植瘤细胞内获得了稳定表达, 荧光显像清晰稳定;自行研发的荧光活体成像仪成像清晰,应用其可以 早期发现肿瘤的生长及微转移的形成,及时监测肿瘤的治疗效果;活体、 连续成像观察,无需处死动物;利用荧光分子成像的方法,使得处死动 物模型获取组织、判断分析肿瘤生长、有否转移、微血管密度计数等繁 琐、复杂的方法,变成简单、直接的影像观察,为研究肿瘤提供了新的 思路和方法,具有重要意义。2、内皮抑素对小鼠LLC移植瘤的生长有 明显抑制作用,内皮抑素可以通过降低VEGF和B。1一2在肿瘤组织中的 表达而抑制肿瘤生长。


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