米非司酮治疗子宫肿瘤机理的体外研究

【摘要】：研究目的：目前，米非司酮治疗子宫肌瘤的研究已从临床观察进入到分子水平，为了进一步了解其机理，本研究：1．观察不同浓度米非司酮作用下体外培养的子宫肌瘤细胞的形态学变化，应用MTT法检测米非司酮对体外培养的子宫肌瘤细胞的生长情况，寻找治疗子宫肌瘤的最佳米非司酮浓度；2．探讨米非司酮治疗子宫肌瘤的分子机理；3：探讨米非司酮治疗子宫肌瘤与凋亡的关系。 研究材料与方法：1．采用不同浓度米非司酮(10~(-8)～10~(-4)mol／L)加入体外培养的子宫肌瘤细胞中，培养3天，光镜下观察其形态学变化并照相，用MTT法测定不同浓度米非司酮作用三天后的肌瘤细胞生长情况，取10~(-6)mol／L、10~(-4)mol／L两组及对照组做电镜观察并照像。2．取对照、10~(-6)mol／L、10~(-4)mol／L三组在盖玻片上生长的肌瘤细胞，行免疫细胞化学法检测肌瘤细胞ER、PR、PCNA、VEGF、TGFβ、Fas、FasL、bcl-2、Caspase3的表达。3．应用酶联免疫法测三组肌瘤细胞分泌PRL的情况。4．应用流式细胞仪测三组肌瘤细胞的凋亡情况及细胞周期。 结果：1．肌瘤培养成功率58.8％，不同的肌瘤所需消化时间 天津医科大学博士学位论文中文摘要 稍有差异;消化下来的细胞经台盼蓝染色，细胞成活率达90%。 细胞24小时贴壁，5一7天约70一80%汇合成片。2.光镜下观察肌 瘤细胞呈梭形生长，卵圆形核;10一8一10一吮。讥米非司酮对细胞生 长无影响，10一6mo比时肌瘤细胞开始萎缩，1丫mo比时细胞成圆 球形，绝大多数死亡，但a一SMA染色均为强阳性。3.电镜观察: 对照组:核膜、核仁清晰，细胞膜结构及细胞器较活跃，细胞可 见伪足样结构。10一6mol几组:见细胞呈收缩状态，部分膜结构溶 解破坏，胞浆多呈空网结构，核仁固缩，染色体裂解。10一4mol几 组:细胞变性水肿，胞膜、核膜破坏，核染色体固缩变形。4.解T 检测结果显示:10.6mol几浓度米非司酮对细胞的生长开始抑制， 随浓度增加，抑制作用增加。5.免疫细胞化学法可见，米非司酮 下调体外培养的子宫肌瘤细胞ER、PR、PCNA的表达，上调 easpase3、bel一2、Fas、VEGF、TGFp的表达，米非司酮对肌瘤细 胞的FasL的表达无明显意义，并且抑制PRL的分泌，差异极显著 (p0.05)。6.流式细胞仪对三组细胞检测:对照组无凋亡细胞， GO/Gl期:96.190，0、S期:0.17%、GZzM期:3.64%;10一6mol/L组: 凋亡细胞3.18%，G。/G:期:94.61%、S期:2.19%、GZ从期:3.20%; 20一4mol/L组:凋亡细胞4.71%，G。/GI期:95.01%、S期:2.61%、 GZ/M期:2 .38%。 天津医利大学博士学位论文 中文摘要 结论:1、如采用适当浓度的消化酶，并掌握好消化时间，注 意无菌操作，可提高子宫肌瘤体外培养的成功率。2、从光镜和电 镜观察结果可见，米非司酮破坏肌瘤细胞结构，干扰核膜、胞膜、 细胞器、及染色体，并与米非司酮浓度成正相关。3、通过MTT 检测，10一“mof几米非司酮浓度对肌瘤细胞有抑制作用，10一知。比 抑制作用最强，这与文献报道一致。4、米非司酮下调ER、PR的 表达，推测米非司酮缩瘤机制除了竞争性与PR和非竞争性抑制 EZ、P在子宫肌瘤中的作用外，还干扰PR、ER的表达。此种作用 与浓度成正相关。5、米非司酮可直接抑制肌瘤细胞自分泌PR工的 作用，推测通过干扰肌瘤细胞的自分泌/旁分泌而使肌瘤缩小，此 种作用与浓度成正相关。6、米非司酮上调肌瘤细胞VEGF、TGFp 的表达，且只有达到10一4mol几时才有显著差异，这与文献不一致。 因文献中研究的是米非司酮对人体肌瘤的作用，推测VEGF、TGFp 的表达是否与肌瘤细胞萎缩变形有关，在人体内的作用可能与干 扰EZ、P的活力而下调VEGF、TGFp有关。7、米非司酮上调肌 瘤细胞bel一2、Fas及casPase3的表达，与浓度成正相关，且只有 达到10一场。讥时才有显著差异，推测米非司酮通过Fas正asL、 bcl一2、casPase3的相互作用而促肌瘤细胞凋亡。而流式细胞仪所测 结果凋亡细胞并不多，是否与米非司酮对肌瘤细胞的作用时间较 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 短，只引起细胞早期凋亡，DNA未解体，而流式细胞仪对此不灵敏 所致。