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汉坦病毒S基因克隆及其在毕赤酵母系统中的表达

魏骏飞  
【摘要】:肾综合征出血热是一类危害较大的新现病毒性疾病,汉坦病毒是它的病原体,在我国以汉滩型和汉城型为主,其代表毒株分别为Z10株和L99株。在病毒的基因组中S基因所编码的核蛋白是病毒的主要结构蛋白,构成病毒核衣壳的主要成分。核蛋白具有很强的抗原性及免疫原性,高度保守,患者对核蛋白的抗体应答不仅出现的早且滴度高。因此,核蛋白可以用作理想的诊断抗原。巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种新型外源基因表达系统,兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工,表达基因插入整合在染色体上更为稳定,且发酵条件简单,适宜高密度培养,具高效表达的优势,易于纯化,为其产业化提供极大方便。 本文分别从汉坦病毒汉滩型Z10株和汉城型L99株感染的Vero-E6细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增获得全长S基因片段,插入pGEM-T-Easy载体中,经酶切鉴定及序列分析,证实了基因片段的正确插入。继而,将重组质粒pGEM-T-Easy-Z10-S和pGEM-T-Easy-L99-S中的外源片段插入毕赤酵母分泌表达载体pPICZα,经酶切鉴定及核苷酸序列分析证实重组质粒pPICZαA-Z10-S和pPICZαC-L99-S的读码框架正确,并经3D—PASSM server软件分析预测目的蛋白空间结构无改变。重组质粒经SacI酶切线性化后导入毕赤酵母菌X-33进行插入整合,PCR鉴定证实S基因已插入酵母菌的染色体中,分别命名为Z10-S/X-33株和L99-S/X-33株。重组菌株经0.5%甲醇诱导表达,培养液上清经SDS-PAGE电泳显示其表达S基因目的蛋白分子量与预期结果相一致。此外,表达蛋白Dot Blot抗原性鉴定结果显示可被肾综合征出血热患者的阳性血清所识别。汉坦病毒S基因的克隆及其在毕赤酵母系统中表达,为其深入研究奠定了基础。


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