兔骨髓间充质干细胞生物学特性和自体皮下移植的成骨研究

【摘要】：目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的生物学特性,地塞米松(dexamethasone, DEX)对BMSCs向成骨细胞诱导分化的最佳作用浓度,评价以BMSCs为种子细胞,10%珊瑚羟基磷灰石(coral hydroxyapatite, CHA)为支架材料构建的组织工程骨自体皮下的成骨能力。1.兔骨髓间充质干细胞的生物学特性和向成骨细胞诱导分化的研究 方法 利用密度梯度离心法以1.073g/ml的淋巴细胞分离液梯度离心和塑料粘附贴壁的方法提取兔骨髓中的BMSCs,以不同浓度DEX10~(-6)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-9)mol/L作用于将传代培养的第2代BMSCs,以未添加DEX为对照组(n=5),在1、3、5和7天观察并用MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测BMSCs增殖的变化;在1、2、3和4周检测BMSCs成骨细胞分化指标,包括定量法检测碱性磷酸酶(ALP)的表达,免疫组化法检测BMSCs分泌Ⅰ型胶原和四环素荧光法检测矿化结节的形成。将BMSCs在无血清的低营养环境中,分别培养1、2、3、4、5、6和7天,以正常血清培养为对照组,MTT法检测在含13%胎牛血清的DMEM培养基恢复培养后3天(n=4)和7天(n=3)的BMSCs增殖结果。 结果 梯度离心法从骨髓中获得粘附贴壁、呈纺锤形的BMSCs。DEX作用1天BMSCs增殖变化,DEX浓度10~(-6)mol/L组获得的结果最高,与其余各组相比有明显差异;3和5天,对照组结果最低,与各组差异有显著性;7天时,对照组结果最低,DEX浓度10~(-9)mol/L组结果最高,与各组差异有显著性。BMSCs向成骨细胞分化,4周时各组ALP的表达明显升高,其中以10~(-9)mol/L组和10~(-8)mol/L组升高最为明显,有显著差异性。4周时,Ⅰ型胶原免疫组化染色10~(-9)mol/L组和10~(-8)mol/L组可见大量胞质呈棕色的阳性细胞,5周