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子痫前期胎盘组织差异表达基因的克隆和初步鉴定

贾艳菊  
【摘要】:背景和目的: 子痫前期病因和发病机制仍未完全阐明,始终为产科研究的焦点。基因表达异常是子痫前期发生及发展的根本原因,寻找子痫前期的易感基因并研究其表达情况成为当前研究本病的重点。本研究应用荧光mRNA差异显示技术筛选子痫前期患者与正常孕妇胎盘组织差异表达的基因,并进行克隆及初步鉴定,进一步探讨子痫前期发生发展的分子机制,为其遗传学和易感基因的研究提供新的思路。 材料和方法: 1.差异表达基因的筛选和克隆:应用荧光mRNA差异显示方法寻找重度子痫前期患者及正常孕妇胎盘组织差异表达的cDNA片段,PCR再扩增并克隆差异基因片段,经蓝白斑筛选,提取及纯化质粒后,EcoR Ⅰ酶切鉴定。 2.差异表达基因的序列测定和分析:应用末端双脱氧法进行DNA序列测定。在互联网上经BLAST软件检索,将测序结果与国际基因序列数据库进行同源性对比,将同源性较低的序列提交GenBank,申请新的登录号。 3.差异表达基因的初步鉴定:提取重度子痫前期患者及正常孕妇胎盘组织的总RNA,以差异表达的基因片段为模版制备同位素α-~(32)P标记的探针,进行Northern印迹杂交;将两组胎盘组织的总RNA逆转录为cDNA,依据差异基因mRNA序列合成上、下游引物,进行半定量RT-PCR,通过凝胶成像分析系统测定目的基因与内参β-actin光密度的比值,比较二者mRNA的表达水平;应用免疫组化方法比较两组胎盘组织差异基因编码蛋白的表达情况。


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