大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的体外实验研究

【摘要】：目的:探讨抗氧化剂二甲基亚砜(DMSO)/丁羟茴醚(BHA)和脑源性神经营养因子(BDNF)/碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)/全反式维甲酸(RT-RA)两种诱导方法对Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞诱导分化的作用。 方法:采用贴壁培养法体外培养、纯化MSCs,并用流式细胞术进行细胞表型鉴定,测定CD90、CD31、CD34阳性细胞百分率。 采用抗氧化剂(2% DMSO和200umol/L BHA)和细胞因子(10ug/L BDNF和20ug/L bFGF)/全反式维甲酸(1umol/L RT-RA)两种诱导剂分别对MSCs进行体外诱导,促其向神经元分化,倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化,胎鼠皮肤成纤维细胞作为阴性对照组;用逐格摄影方法观察抗氧化剂(DMSO/BHA)分别诱导MSCs和胎鼠皮肤成纤维细胞0min、15min、30min、45min、60min、90min时细胞形态变化,以及诱导2.5h时换入普通培养液后0min、15min、30min、60min细胞形态变化。 免疫细胞化学方法检测诱导前后神经前体细胞、神经元和神经胶质细胞特异标记物如nestin,MAP-2,NSE和GFAP的表达。 用全细胞膜片钳技术对诱导前MSCs和诱导后神经元样细胞进行电生理功能鉴定,以急性分离的大鼠海马神经元作为阳性对照组。 结果:培养第3代MSCs经流式细胞仪检测,显示MSCs的均一性达95%,三个细胞表型的阳性标记率分别是:CD90∶99%,CD31∶3.4%,CD34∶0.3%。 抗氧化剂(DMSO和BHA)在0.5h内即可诱导MSCs产生神经元样细胞,4h诱导率最高为86.47%±5.56%,细胞因子(BDNF,bFGF)/全反式维甲酸(RT-RA)24h内方可诱导出神经元样细胞,72h诱导率最高为24.01%±3.76%,两组诱导率有显著差异(P0.01);抗氧化剂(DMSO和BHA)诱导胎鼠皮肤纤维细胞同样产生了神经元样细胞,细胞因子(BDNF和bFGF)/全反式维甲