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应用亚低温治疗蛛网膜下腔出血导致的迟发血管痉挛的动物研究

徐翔  
【摘要】: 目的:建立稳定可靠的SAH动物模型,从脑血流的改变、脑底大血管的病理改变、神经细胞的凋亡及其相关基因的表达以及局部脑微环境生化代谢变化等方面,探讨亚低温对于蛛网膜下腔出血后迟发血管痉挛的脑组织的保护作用。 材料与方法: 1、选择成年SD大鼠作为模型动物,采取改良的枕大池二次注血建立蛛网膜下腔出血模型。于二次注血后第5天进行研究,亚低温组用冰袋全身降温治疗另两组维持体温在正常范围。 2、应用激光多普勒(LDF)监测大鼠皮层脑血流的变化以及脑底大血管的病理改变证实血管痉挛的发生。 3、通过光镜、电镜研究对比脑底大血管的大体及超微结构变化,来探求亚低温对于迟发血管痉挛的治疗作用。 4、采用原位缺口末端标记(TUNEL)法研究SAH大鼠海马CA1区神经组织细胞凋亡情况、采用免疫组化方法研究该区神经细胞的凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达以及采用实时荧光定量PCR技术研究对皮层、脑干以及海马三处脑神经组织细胞凋亡调控基因ICE及Bcl—XL mRNA在脑神经组织中表达变化,并初步探讨SAH后亚低温在减少迟发血管痉挛后细胞凋亡方面的治疗作用。 5、利用微透析技术对SAH大鼠第五天进行连续检测8小时。检测指标为葡萄糖(Glu)、乳酸(Lac)、丙酮酸(Pyru)和乳酸/丙酮酸比值(L/P)。 结果: 1、本实验大鼠的死亡率约为(10%),蛛网膜下腔出血模型鼠血液主要分布于基底池、脚间池及额叶底面,亚甲蓝与血液混合物主要沉积于颅底,同时在脑室及纵裂池亦可见血液分布。假手术组大鼠注入人工脑脊液后未见发生颅内出血及血液沉积现象。另外LDF监测结果以及大鼠基底动脉光电镜的不同都证实动物模型制作成功。 2、对比皮层脑血流发现,假手术组有轻微脑血流变化。分析每小时的亚低温组和对照组的脑血流都出现明显下降趋势,并且都与假手术组有明显统计学差异。而亚低温组与对照组无明显差异。 3、对比三组大鼠基底动脉光镜结果发现,与假手术组相比,另两组均发生了明显的血管痉挛,表现为血管直径减小、管壁增厚、管腔周长减少、内弹力膜皱褶,同时可见痉挛血管细胞增殖现象明显,但亚低温组好于对照组。测量发现对照组基底动脉直径减少了50.59%,管壁厚度增加了159.27%,管腔内周长减少了62.50%。亚低温组好于对照组,其中管壁厚度明显低于对照组。(3)透射电子显微镜观察:与假手术组比较,另两组内皮细胞出现类凋亡样变化,包括内皮细胞膜起泡,胞质凝聚,胞浆空泡变,核染色质凝聚、趋边等现象,显示基底动脉呈痉挛状态。其中以对照组最显著,伴有大量内皮细胞的剥离导致内弹力膜的裸露,平滑肌细胞的坏死。亚低温组未见细胞膜破裂,紧密连接尚好,内弹力膜未见裸露,细胞连接未见明显改变,胞质中细胞器结构尚清晰,可见内质网、高尔基氏器、胞饮小泡、微丝及核糖体,细胞间连接未见明显损伤,仍可见缝隙连接。 4、大鼠海马CA1区HE染色发现对照组神经细胞大部分细胞核浓缩、深染、溶解、消失,细胞间隙加大,神经元密度均明显减少。亚低温组海马CA1区部分神经细胞,胞浆深染,细胞核固缩,存活神经元较对照组明显增多;TUNEL检测发现对照组可见大量凋亡细胞,细胞核固缩呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒。亚低温也可见凋亡细胞,但是与对照组相比明显减少且有统计学差异;亚低温组Bcl-2免疫反应强度高于对照组(p<0.05)及假手术组,而对照组Bax免疫反应强度与假手术组相比明显增强(p<0.01)。亚低温组Bax免疫反应强度虽升高,但其强度明显低于对照组(p<0.05);荧光定量PCR结果显示:三组大鼠间的ICE在各脑区间都有统计学差异,其值为:对照组>亚低温组>假手术组。三组间的Bcl-XL在各脑区间都有统计学差异,在皮层、脑干中以亚低温组最高,而假手术组最低;在海马中对照组与假手术组之间没有统计学差异。 5、Glu和Pyru的变化:假手术组>亚低温组>对照组;Lac变化:对照组>假手术组>亚低温组;L/P变化:对照组>假手术组>亚低温组。LSD比较以及重复测量结果均显示,Lac、Pyru和L/P在假手术组和亚低温组之间无统计学差异,而对照组与另两组差异显著(p<0.05)。假手术组Glu与另两组之间差异显著(p<0.05)。亚低温组与对照组无差异。 结论: 1、通过对国内外报道的枕大池二次注血模型的修改,我们认为本实验所使用动物模型可以作为对比亚低温疗效的可靠实验平台。 2、另外亚低温治疗并不会明显降低血管痉挛期大鼠脑皮层的血流量。从而为发挥亚低温降低脑代谢率、保护缺血脑组织的作用提供保证。 3、我们认为亚低温治疗可能在一定程度上减轻或减缓血管壁的病理改变,从而对维持脑供血、减轻因脑缺血造成的神经细胞损害起到积极的作用。 4、对比神经细胞的凋亡及其相关基因的表达的差异,我们认为亚低温治疗可以通过减轻或者缓解血管痉挛期大鼠神经细胞的凋亡发生,从而起到脑保护的作用。 5、微透析的对比研究结果显示,亚低温治疗可能通过减少脑组织对能量的需求、部分缓解无氧代谢的进程、维持细胞能量代谢、减少乳酸堆积造成的脑损害。


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