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基于可变数目串联重复序列分型方法的结核分子流行病学研究

巨韩芳  
【摘要】: 目的:初步探讨15个可变数目串联重复(Variable Number Tandem Repeat,VNTR)位点在天津地区结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)中的多态性、天津地区的主要流行菌株以及VNTR分型方法在结核分子流行病学中的主要应用。 方法:选取天津市结核病控制中心参比实验室菌种库中2005年6月至2006年4月的100株MTB,收集这100例确诊肺结核患者的一般资料和实验室资料。将菌株复苏传代,提取其基因组DNA。采用PCR方法扩增结核菌基因组中的15个VNTR位点,包括由12个结核分枝杆菌散在重复单元(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit,MIRU)和5个精确串联重复序列(Exact Tandem Repeats,ETR)(其中的两个与MIRU位点一致)。扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳后,应用Bio-Rad凝胶成像系统观察PCR产物并通过Quantity One4.4分析软件确定PCR产物的片段长度并与标准菌株H_(37)Rv比较计算得到每个菌株不同串联重复位点的拷贝数,将部分菌株的VNTR位点PCR扩增产物经纯化后直接测序;评价每个VNTR位点的多态性以及MIRU位点和ETR位点对天津地区结核菌株的综合分辨能力。应用PAUP4.0软件绘制系统树图,揭示菌株之间的相互关系。根据VNTR基因分型结果,设计调查表,收集成簇菌株的患者资料,用以追踪同一簇患者间的相互传播途径。应用SPSS11.5进行卡方检验和单因素Logistic回归分析。 结果: 1、基本资料描述:本次研究中的100株MTB分别来自100名肺结核患者,患者的男女比例为1.9:1,年龄的中位数为36岁(15-82岁),以20-29岁患者比例最高。市内六区患者占患者总数的81%,初治患者占81%,有卡介苗接种史的患者占68%。 2、本次研究中58株MTB的5个ETR-VNTR位点拷贝数编码均为42435,另有两株编码分别为42436和42433,均属于具有北京家族VNTR分型特点的菌株,共占实验菌株总数的60%。 3、5个ETR-VNTR位点仅将菌株分为23个基因型,独立株17株,6个簇,最大簇包含58株菌;12个MIRU-VNTR位点将菌株分为45个基因型,独立株36株,9个簇,最大簇包含34株菌;MIRU和ETR-VNTR相结合后将菌株可被分为52个基因型,独立株41株,11个簇,最大簇包含29株菌。成簇组与非成簇组患者在性别,年龄,住址,治疗史,卡介苗接种史等方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。 4、VNTR位点等位基因多样性(h)分析结果显示:MIRU-26和MIRU-31位点多态性较好h分别为0.54和0.45;其次为MIRU-10,40和ETR-A,0.3<h<0.4;MIRU-39,27,0.2<h<0.3;MIRU-4,16,23和ETR-C,0.1<h<0.2;MIRU-2,20,24和ETR-B的多样性最低h<0.1。不同VNTR位点组合对结核分枝杆菌的分辨能力比较结果显示:单独使用5个ETR位点、12个MIRU位点和两者结合后分辨能力HGDI分别为0.6503,0.8622和0.9093。 5、PAUP分析表明,100株MTB可被分为三组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),其中89株菌属于第Ⅲ组,属于Ⅰ,Ⅱ两组的菌株分别为6株和5株。 6、对成簇组的结核病患者资料进一步调查发现,其中2名患者为相继发病的某中学同班同学,可以确定这两名患者处于同一条传播链上。 结论:15个VNTR位点中MIRU-10,26,31,40和ETA五个位点在天津地区流行的MTB中多态性较好,其余位点对菌株的分辨能力欠佳。MIRU和ETR-VNTR位点还不足以达到理想的分型效果,还应再引入其他多态性位点。天津地区可能是北京家族菌株的高流行区,应加强对该类菌株的预防和控制。VNTR分型方法可广泛用于结核病的分子流行病学研究。


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