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干扰RhoA表达修复脊髓损伤的实验研究

张宏志  
【摘要】: 目的 检测大鼠脊髓损伤后不同时间RhoA的表达,探讨其与神经轴突再生、脊髓功能之间的相关性,并通过C3干扰RhoA的表达,探讨其治疗脊髓损伤的疗效,为修复脊髓损伤提供新策略。 方法 1.在基因表达和蛋白质翻译双重水平上,观察脊髓损伤后不同时间RhoA的表达情况 Wistar大鼠80只,随机分为对照组(40只),实验组(40只)以IMPACTOR-Ⅱ法建立T10急性脊髓损伤模型,分别于造模成功后8小时、24小时、3天、7天和2周对照组和实验组各取4只实验动物,提取损伤段脊髓的总RNA,实时定量PCR和凝胶电泳检测RhoA mRNA的表达;两组另取4只动物于上述时间段,行损伤段脊髓冰冻组织切片,免疫组化染色观察RhoA蛋白表达情况。 2.通过C3干扰RhoA表达,观察对大鼠脊髓功能恢复情况的影响 Wistar大鼠36只以IMPACTOR-Ⅱ法建立T10急性脊髓损伤模型,造模成功后随机分为3组,每组12只,分别为:对照组、脊髓损伤局部多点注射C3组(1.75mg/kg,分3个点注射)和尾静脉注射C3组(250μg/kg/天,造模后连用7天)。造模7天后每组各取4只动物进行实时定量PCR检测和组织切片免疫组化染色,测定RhoA活性;每周对各组实验动物脊髓损伤后运动功能的恢复情况进行行为学评分(BBB评分法);12周后进行BDA(biotinylated dextran amine,生物素化葡聚糖胺)神经顺行示踪标记,标记2周后取出实验动物损伤段脊髓,行5μm快速冰冻切片,并进行进行荧光染色及HE染色。 结果 脊髓损伤后8小时RhoA mRNA表达开始增高,伤后3天达高峰,7天后开始降低,2周时表达显著降低,与对照组无显著性差异;免疫组化染色显示:RhoA蛋白于脊髓损伤后3天染色明显增强,并持续高表达2周。 脊髓损伤后7天实时定量PCR及组织切片免疫组化结果显示:两实验组(脊髓损伤局部多点注射C3组和尾静脉注射C3组)RhoA表达较对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而两实验组之间无显著性差异;BBB评分4周以后组间比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中尾静脉注射C3组明显高于对照组(P<0.05);12周后HE染色,光学显微镜观察显示,应用C3组,有部分神经纤维通过损伤部位,而对照组几乎未见再生神经纤维穿越,两组都可见脊髓空洞及胶质瘢痕形成;12周BDA神经示踪显示实验组轴突再生延伸明显增加,皮质脊髓束再生延伸,部分可以通过损伤区到达远端。 结论 大鼠脊髓损伤后RhoA mRNA表达明显增高,且具有明显时间曲线,RhoA蛋白表达增高较mRNA略有延迟;脊髓损伤后早期,C3可以通过血脊髓屏障到达损伤区干扰RhoA表达,并通过抑制RhoA活性,改善损伤局部微环境,促进神经纤维再生和脊髓功能恢复。


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