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大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及原核表达载体的构建

范海鸣  
【摘要】: 目的:心肌梗死已经成为严重危害人类健康的主要心血管疾病之一。心肌梗死早期心肌缺血预适应主要通过改善心肌细胞的能量代谢对心肌产生保护作用。ATP合酶是细胞能量代谢中最重要的酶,寡霉素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity-conferring protein,OSCP)作为ATP合酶上受到寡霉素调节的部位,直接参与能量代谢的调节。因此,通过对OSCP敏感部位基因转录及表达调控的研究可能为从调节能量代谢角度研究预适应心肌保护作用的机制提供新的方向。故本实验旨在通过克隆大鼠OSCP基因全长cDNA,并构建重组原核表达载体,为后续OSCP蛋白表达、活性鉴定及抗体制备等方面的研究工作奠定基础。 方法:本实验采用RT-PCR等分子生物学技术对OSCP基因进行了扩增和克隆方面的研究,具体如下: 1.提取大鼠脑组织总RNA:采用一步法从新鲜大鼠脑组织中提取总RNA。紫外分光光度计测量其在260 nm和280 nm波长的光密度,计算A_(260)/A_(280)比值确定总RNA的纯度;根据测定的A_(260)值计算RNA的浓度;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。 2.RT-PCR:根据GeneBank中大鼠OSCP基因序列,采用国际通用的分子生物学软件Primer 5.0和Oligo 4.01分别设计上、下游引物: 上游引物为:5′-AGGATCCATGGCCGCACCAGCAAC-3′ 下游引物为:5′-AGTCGACTCAGAGCAGATCCCGCATG-3′ 其中上游引物中引入了限制性内切酶BamH I的识别位点GGATCC,下游引物中引入了限制性内切酶Sal I的识别位点GTCGAC。引物的合成由上海生工生物公司完成,用于RT-PCR反应。采用Oligo(dT)_(15)为逆转录引物,以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成与mRNA互补的单链DNA。用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因OSCP,以增加扩增基因的保真性。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 3.重组克隆载体的构建及鉴定:将PCR产物回收纯化后,将其与克隆载体pTA2进行连接。将连接产物转化感受态细菌E.coli DH5α。扩增转化后的细菌,碱裂解法提取质粒,用EcoR I进行酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒。进行基因序列测定,测序结果用Gene Runner、BLAST软件进行分析。 4.重组表达载体的构建及鉴定:重组质粒pTA2-OSCP经BamH I和Sal I双酶切后进行纯化,将回收的目的片段OSCP与经同样酶切和纯化的原核表达载体pQE30-Xa片段用T_4 DNA连接酶连接。将连接产物转化感受态细菌E.coli DH5α。扩增转化后的细菌,碱裂解法提取质粒,用BamH I和Sal I进行双酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒。进行基因序列测定,测序结果用Gene Runner、BLAST软件进行分析。 结果:本实验对总RNA、RT-PCR产物、重组克隆载体和重组表达载体均进行了检测和鉴定,如下: 1.总RNA的纯度、浓度及完整性检测:总RNA的OD_(260nm)/OD_(280nm)为1.87,纯度较好;RNA浓度为2989.8μg/ml;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果表明所提总RNA完整性较好。 2.目的基因片段的RT-PCR扩增:RT-PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳,在约700 bp处出现一清晰的特异性条带,与已发表的OSCP基因序列大小相同。 3.重组克隆载体的鉴定:重组质粒pTA2-OSCP经EcoR I单酶切鉴定,得到约3000 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,结果与预期设计大小相符;重组质粒pTA2-OSCP经PCR鉴定,得到约700 bp的PCR产物,结果与预期设计大小相符;选取阳性重组质粒进行测序,测序结果与GeneBank数据库进行比较分析,显示与已公布的大鼠OSCP基因序列同源性为100%。 4.重组表达载体的鉴定:pQE30-Xa-OSCP经BamH I、Sal I双酶切鉴定,得到约为3500 bp和约700 bp的两条线性片段,结果与预期设计大小相符;pQE30-Xa-OSCP经PCR鉴定,得到约700 bp的PCR产物,结果与预期设计大小相符;选取阳性重组质粒进行测序,测序结果与GeneBank数据库进行比较分析,显示与已公布的大鼠OSCP基因序列同源性为100%。 结论:本实验成功克隆了大鼠OSCP基因全长cDNA序列,并构建了重组克隆载体pTA2-OSCP和重组原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。


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