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移植肾急性排斥相关免疫基因芯片的构建及临床应用的初步探讨

郑建明  
【摘要】: 目的:构建与免疫基因相关的基因芯片,并利用其筛选出与急性排异反应相关的差异表达基因。对筛选出表达量增高的基因,通过聚类分析,确定高表达基因,并用定量PCR对该高表达基因进行定量分析,从而验证构建基因芯片的稳定性及准确性。对具有代表性的基因进行临床应用的初步研究。 方法:通过自行设计的包含有CD分子、细胞因子、趋化因子、粘附因子、FasL、穿孔素、颗粒酶B等共475个免疫相关基因的基因芯片,对临床上肾移植术后发生急性排斥反应和非急性排异反应患者进行了研究。以手术后第四天和移植肾肾穿刺活检当日/随访日收集外周血作为对照血样和实验血样,用Ficoll技术提取外周血淋巴细胞,并采用一步法提取总RNA,逆转录合成cDNA探针,荧光染料标记后,与芯片进行杂交,扫描后筛选出差异表达基因。对筛选出表达量增高的基因,通过聚类分析,确定高表达基因,并用定量PCR对该高表达基因进行定量分析。根据发现与急性排斥反应相关的基因,初步探讨其在移植肾急性排斥反应发生中的机理;对具有代表性的穿孔素、颗粒酶B、IL-4进行PCR定量,并对穿孔素、颗粒酶B进行临床应用研究。 结果:研究发现外周血淋巴细胞中与急性排斥反应可能相关的免疫基因,筛选出急性排斥反应时表达量出现差异的基因,其中急性排斥发生时外周血淋巴细胞免疫相关基因差异表达上调20条,包括:IL-4、IL-6、IL-10、IL-2、IL-15、INF-γ、TNF-α、CD126、CTLA-4、IL-5、IL-13、IL-18、CD40L、Perforin、GranzymeB、FasL、MCP1、CD30、HLA-DR、MIP-1。下调11个基因,包括:TGFB1、RAB5C、RAB6C、RAB10、IL-17、IL-12、CD4、CD47、CD24、CD79B、CD81。而在非急性排异组患者中并没有发现上述基因的显著改变。对其中的穿孔素、颗粒酶B、IL-4进行实时免疫荧光PCR定量验证,证实他们在急性排异反应时较肾功能稳定时出现量上出现显著性升高(P<0.05),治疗后显著下降(P<0.05)。 应用实时荧光定量PCR对临床上38例移植肾急性排异反应和20例移植肾功能稳定患者进行研究,发现应用外周血淋巴细胞的穿孔素mRNA水平来诊断移植肾急性排异反应的敏感度为86.8%,特异度为80%。临床应用外周血淋巴细胞的颗粒酶mRNA水平来诊断移植肾急性排异反应的敏感度为86.8%,特异度为90%。临床应用外周血淋巴细胞的IL-4的mRNA水平来诊断移植肾急性排异反应的敏感度为86.8%,特异度为75%。 结论:本课题通过自行设计的具有475个免疫相关基因的基因芯片,对临床上肾移植术后发生急性排斥反应患者进行了研究。并应用PCR定量验证,结果显示此基因芯片具有良好的稳定性、准确性。发现了外周血淋巴细胞中与急性排斥反应可能相关的免疫基因,筛选出急性排斥反应时表达量出现差异的基因,其中急性排斥发生时外周血淋巴细胞免疫相关基因差异表达上调20个、下调11个。对具有代表性的穿孔素、颗粒酶B、IL-4进行PCR定量,发现三者在移植肾急性排异反应时明显升高。临床应用外周血淋巴细胞的穿孔素、颗粒酶、IL-4mRNA水平来诊断移植肾急性排异反应的具有较好的敏感度和特异度。


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