内肥素的克隆表达及与其结合短肽的筛选

【摘要】： 内肥素(visfatin)是一种新发现的具有结合并激活胰岛素受体,模拟胰岛素作用的肽类激素。内肥素有多种生物学效应,在体内和体外实验中具有类胰岛素作用,导致其自发现以来成为内分泌研究领域的又一研究热点。内肥素能结合并激活胰岛素受体,但与胰岛素在胰岛素受体的结合部位上存在差异。目前其确切生理作用和在胰岛素受体上的具体结合域并不十分清楚,是否存在其自身的特异性受体尚有待于进一步研究。 为获得大量高纯度重组内肥素,本实验首先构建内肥素的高效表达系统。本实验采用Trizol法自人大网膜脂肪组织中提取内脏脂肪组织总RNA,并以之为模板通过RT-PCR的方法扩增人内肥素成熟肽编码基因。将该基因克隆入pGM-T载体,并进行DNA序列分析。在此基础上,将编码人内肥素的基因片段克隆到表达载体pQE-30Xa上,并转化入E.coli M15[pREP4],进行融合表达。目的蛋白含6×His纯化标签,可以经金属螯合亲和层析吸附于Ni-NTA树脂层析柱,梯度增加冲洗液中咪唑浓度以除去非特异吸附的杂蛋白后,最终将目的蛋白洗脱,超滤离心法浓缩并初步纯化蛋白。随后经Xa因子酶切处理,去除融合标签,将融合标签经金属螯合亲和层析吸附于Ni-NTA树脂层析柱。表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定无误。蛋白表达条件经优化后,重组蛋白占菌体总蛋白的42.634%,内肥素的表达量达到300mg/L培养基,属于高效表达,成功构建了内肥素的高效原核表达系统。目的蛋白只含有内肥素成熟肽序列,最终经纯化后的内肥素纯度为95.629%。通过蛋白质—蛋白质相互作用测定内肥素与胰岛素受体的结合活性,证明实验得到的表达产物内肥素能与胰岛素受体结合,具有生物活性,并具备一定的剂量依赖关系。 为研究与内肥素结合的多肽序列,将纯化后的内肥素包被于培养平皿上,通过噬菌体展示技术对噬菌体随机七肽文库进行三轮淘选后,表面展示有与内肥素能发生特异性结合的多肽序列的噬菌体被富集。富集后的噬菌体最后被洗脱下来,随机对其中24个阳性克隆进行DNA序列分析,根据DNA序列分析的结果,推断出与内肥素特异性结合的多肽模序。随后通过ELISA证实,所有经淘选获得的序列均能与内肥素发生特异性结合,且随噬菌体滴度的下降,在410nm的吸光度呈一定的梯度下降。根据对24个噬菌体DNA测序结果的比较,发现在这些序列中,AAKTPTE、ATTVPAS以及MSLQQEH短肽出现的频率最高,分别有8个、4个和4个克隆。通过对己测序的结果进行分析,可以发现AA(X)TPT(X)这个序列的出现的频率很高,这个序列很可能就是与内肥素相结合的多肽的最基本的模序。