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光动力疗法对口腔生物膜致龋变形链球菌抑制作用的研究

邹朝晖  
【摘要】: 龋病是危害人类健康的第三类疾病,它对健康的危害仅次于心血管疾病和肿瘤。变形链球菌等致龋微生物在口腔生物膜内形成牙菌斑,并进行产酸代谢活动是产生龋病的直接原因。因此,通过适当方法影响口腔生物膜内的细菌代谢,干扰牙菌斑的形成或促进牙菌斑的解离,即可达到预防龋病的目的。现有防龋方法中氟化物防龋法虽已得到普遍公认,但氟化物使用的安全性问题和变形链球菌耐氟菌株的出现都为预防龋病提出了新的课题。寻找更为安全有效的防龋方法是目前急需解决的问题。 光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)目前已成为肿瘤的基本治疗手段之一;近年来,在非肿瘤性疾病特别是细菌性疾病和病毒性疾病的治疗上,PDT也取得了显著的疗效。鉴于目前国外已有实验室开展PDT对单一口腔致龋菌的实验研究,但未见在人工龋模型上的实验研究,本研究从龋病预防的角度出发,探讨PDT对人工龋口腔生物膜致龋变形链球菌的作用。 目的: 构建符合人体生理环境的人工龋模型,并将其应用于PDT防龋实验;探讨PDT对口腔生物膜中主要致龋菌(变形链球菌)的作用;分析PDT过程中不同剂量的光敏剂对抑菌效果的影响,通过实验选择适宜预防龋病的激光能量剂量;结合DiO、Hoechest33342两种荧光探针在细胞水平上探讨PDT的防龋机制;为PDT防龋的临床实践提供理论与实验依据。 方法: 1.选用变形链球菌在体外构建符合人体生理环境的人工龋模型,并对人工龋模型中口腔生物膜生长曲线进行测定和釉质块表面显微硬度进行测试。 2.PDT防龋剂量的选择:应用不同能量剂量635nm的半导体激光和血卟啉单甲醚(HMME)作用于人工龋,观察PDT过程中不同能量剂量对抑菌效果的影响。 3.通过HMME-PDT对细菌生长的抑制、对细菌产酸的抑制,观察PDT对细菌代谢的影响。 4.通过显微硬度分析和原子吸收光谱分析PDT对牙齿表面硬度和钙含量的影响。 5.通过荧光显微镜结合DiO、Hoechest33342两种荧光探针,探讨PDT在细胞水平的防龋机制。 结果: 1.口腔细菌生物膜在48 h生长达到了成熟期。致龋处理后,人工龋组牙釉质表面的显微硬度值(MHV)显著低于对照组(P<0.05)。 2.当半导体激光能量剂量为12.47 J/cm~2时,人工龋模型中变形链球菌的生长受到显著抑制(P<0.05)。当光敏剂HMME剂量适中(20μg/m1)时,PDT才能有效发挥对人工龋口腔生物膜中变形链球菌的杀菌效应(P<0.05)。 3.PDT防龋处理后,人工龋口腔生物膜中变形链球菌数量(CFU/ml)显著减少(P<0.05),杀菌率高达99.36%;变形链球菌产酸能力显著下降(P<0.05)。 4.PDT防龋处理后各实验组MHV由大到小顺序为:单纯激光照射>PDT防龋处理>单纯HMME>0.05%洗必泰>0.9%生理盐水;各实验组钙溶出浓度由小到大顺序为:单纯激光照射<PDT防龋处理<0.05%洗必泰<单纯HMME<0.9%生理盐水。各实验组间比较具有显著性差异(P<0.05)。 5.在HMME-PDT防龋过程中,HMME可选择性与致龋变形链球菌结合,菌体表面呈现红色荧光;同一视野下,当加入细胞膜绿色荧光探针DiO时,菌体表面呈现绿色荧光;当同时还加入Hoechest33342时,虽然基底可见兰色荧光,但未见Hoechest33342与变形链球菌结合。 结论: .采用本研究方法形成的人工龋模型已具备牙釉质早期龋的表现,可用于PDT防龋的实验研究。通过实验选定的HMME-PDT防龋剂量为:HMME剂量为201μg/ml,半导体激光照光剂量为10mW,90s,12.74J/cm~2。PDT可有效杀灭人工龋口腔生物膜中的变形链球菌,并抑制变形链球菌的产酸能力。PDT防龋可减少牙齿钙溶出量,进而显著提高牙齿表面硬度,有利于减慢或阻止龋病的进程。HMME-PDT在防龋过程中的作用靶点位于变形链球菌细胞膜上,激光照射时产生的单态氧和其它活性氧物质(ROS)直接损伤细菌细胞膜系统,影响其新陈代谢,导致细菌死亡,从而取得防龋效果。HMME-PDT是一种有效的防龋方法,在龋病预防中具有广泛的应用前景。


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