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表皮葡萄球菌临床株生物膜形成的检测与药物对生物膜干预作用的实验研究

于树云  
【摘要】: 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)是人类皮肤上广泛存在的共生菌群,通常认为不致病。随着医用生物材料的应用日益广泛,表皮葡萄球菌(简称表葡菌)已成为院内感染的重要条件病原菌。表葡菌的致病性在于能黏附于生物材料及机体粘膜组织表面形成生物膜(biofilm ),生物膜可以保护内部细菌逃避抗菌药物及宿主免疫杀伤,而且生物膜持续释放细菌进入血流引起感染的慢性及反复发作,从而使感染难以清除,最终需要移除感染的植入物。因此,生物膜相关感染严重影响和限制了医学生物材料在临床上的应用,已成为临床亟待解决的棘手难题。 研究目的 1.了解表皮葡萄球菌医院内感染中MRSE的检出率,将头孢西丁纸片法与mecA基因PCR扩增结果比较,为临床治疗合理用药提供帮助。 2.了解表皮葡萄球菌临床株形成生物膜的能力、分析其生物膜形成能力与icaA基因的关系、探讨形成生物膜的分子遗传学基础。 3.了解表葡菌临床株生物膜相关基因icaA的mRNA表达情况;探讨icaA基因表达水平与生物膜形成能力的关系。 4.探索对生物膜细菌有干预作用的药物联合方案,为临床解决生物膜相关感染的难题提供新思路。 研究方法 1.收集2006年1月至2008年8月天津市四家医院院内感染患者标本分离的表皮葡萄球菌临床株进行常规、生化等鉴定,可疑菌株经API Staph纸条鉴定。 2.采用头孢西丁纸片扩散法及mecA基因PCR扩增方法检测MRSE。 3. CRA实验及粘附实验检测表葡菌生物膜的形成能力,生物膜相关基因icaA的PCR扩增;光学显微镜及扫描电镜下观察细菌生物膜的微观形态。 4. icaA基因DNA序列测定,与GenBank已公布的表葡菌icaA序列同源性分析。 5. RT-PCR检测icaA的mRNA转录水平,分析基因表达与生物膜形成的关系。 6.建立硅胶膜上的生物膜模型,采用棋盘法将万古霉素分别与生物膜相关药物(红霉素、赖氨匹林、氨溴索)联合作用于生物膜,采用MTT法和平板计数法测定药物作用后生物膜的菌落密度,并比较两种检测方法的结果。 研究结果 1. 205株表葡菌临床株经mecA基因检测出MRSE187株,检出率为91.2%,头孢西丁纸片扩散法检出苯唑西林耐药183株,耐药率89.3%,两种测方法具有统计学相关性(x~2=46.437, P0.05),两种方法的一致率为91.2%。 2. 205株表葡菌中CRA实验阳性率11.7%,粘附试验阳性率11.2%, icaA基因阳率13.7%, 3种检测方法均阳性9.3%, 3种检测方法间具有统计学相关性(P0.05)。 3.扫描电镜下微观形态:生物膜阳性的表葡菌株可见葡萄球菌聚集成的微菌落,细胞间有胞外粘性基质包绕成团簇状,生物膜阴性菌株未见微菌落形成。 4.表葡菌的icaA基因DNA序列分析:与GenBank已公布的表葡菌ATCC35984(RP62A)同源率97%~100%,均编码N-乙酰葡聚糖转移酶。 5. icaA基因(+)而生物膜表型不同的6株菌RT-PCR检测显示,生物膜阳性菌株的icaA基因转录水平高于生物膜阴性菌株。 6.将万古霉素分别与红霉素、氨溴索或赖氨匹林联合作用于表葡菌生物膜后,MTT法及平板计数法测定结果均显示,药物联合作用比万古霉素单独作用时生物膜的菌落密度明显减少,而且减少程度与药物呈现浓度依赖性。 研究结论 1.表葡菌临床株中MRSE检出率很高,临床宜根据药敏结果慎重及合理选用抗菌药物。头孢西丁纸片法可作为实验室常规筛检MRSE的方法。 2.表葡菌临床株icaA基因阳性率为13.7%,具有一定的形成生物膜的能力;icaA为表葡菌生物膜形成的遗传基础。 3. icaA基因PCR扩增与CRA实验及粘附试验间具有统计学的相关性与一致性。表型检测操作简便、快捷、便于批量测定,可推荐作为实验室常规筛检表葡菌生物膜形成能力的方法,便于向临床及时提供相关信息。 4. icaA基因的表达水平与生物膜形成能力可能有关,有待进一步研究证实。 5.万古霉素联合红霉素、氨溴索或赖氨匹林对表葡菌生物膜显示出协同干预效应。非抗菌素类药物氨溴索与赖氨匹林均可增强万古霉素对生物膜的杀菌作用,有望开拓其抗生物膜领域的应用。


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