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巯基化壳聚糖-pDNA纳米粒的构建及其对HeLa细胞体外转染活性的研究

陈斌  
【摘要】: 目的:制备巯基化壳聚糖。通过巯基化壳聚糖溶液与质粒DNA-(p-DNA)溶液之间的作用,制备巯基化壳聚糖-pDNA纳米粒。研究巯基化壳聚糖作为转基因载体时,体外转染HeLa细胞后报告基因的表达情况。并测定巯基化壳聚糖-质粒DNA(pDNA)纳米粒对HeLa细胞的细胞毒性。 方法:在缩合剂1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)的缩合作用,巯基乙酸与壳聚糖通过酰胺键结合,生成巯基化壳聚糖。傅里叶变换红外光谱仪测量产物的红外光谱;以5-5'-二硫代-双-硝基苯甲酸法(DTNB法)检测巯基化壳聚糖的巯基含量,并用元素分析系统检测合成物中硫元素含量。通过复凝聚法使巯基化壳聚糖和报告基因质粒pcDNA3.1(+)-EGFP结合,制备巯基化壳聚糖-pcDNA3.1(+)-EGFP纳米粒,紫外分光光度法检测纳米粒对pcDNA3.1(+)-EGFP的包封率,Zeta电位和粒度分析仪检测该纳米粒的表面电位和粒径,透射电镜检测纳米粒形态和粒径。将纳米粒先后用DNaseⅠ处理、在肝素作用下解聚,并用琼脂糖凝胶电泳检测,以研究该纳米粒对pcDNA3.1(+)-EGFP的抗DNaseⅠ降解保护作用。MTT法测定以巯基化壳聚糖为载体的纳米粒对HeLa细胞的毒性,并以壳聚糖为载体的纳米粒作为对照。巯基化壳聚糖-pcDNA3.1(+)-EGFP纳米粒对HeLa细胞的体外基因转染实验,观察细胞的荧光阳性率,来近似估计转染效率,并以脂质体转染作为对照;应用SPSS11.5统计学软件对所有结果进行计数资料的统计分析。 结果:红外光谱图显示壳聚糖在EDAC的作用下被巯基化,DTNB法显示每克巯基化壳聚糖的巯基含量为202.85±3.05μmol(n=6);以复凝聚法,氮/磷(N/P)为9.4:1时,巯基化壳聚糖与质粒pcDNA3.1(+)-EGFP能有效地结合形成稳定的纳米粒,包封率大于90%;Zeta电位及粒度分析仪测定结果表明巯基化壳聚糖-pcDNA3.1(+)-EGFP纳米粒的平均粒径为288.7 nm,zeta电位为+(25.2±2.1)mV,电镜下该纳米粒的粒径在300-350 nm之间,为不规则球型,DNaseⅠ保护实验证明该纳米粒能有效保护pcDNA3.1(+)-EGFP免受DNaseⅠ的降解。巯基化壳聚糖-pcDNA3.1(+)-EGFP纳米粒对HeLa细胞生长无明显抑制作用,且对细胞活力的影响与壳聚糖组无差别(P>0.05)。该纳米粒转染HeLa细胞系时绿色荧光蛋白基因能有效表达,但转染效率低于脂质体对照组(P<0.01)。 结论:巯基化壳聚糖-pcDNA3.1(+)-EGFP纳米粒有较好的包封效果、适度的粒径和良好的稳定性,能有效保护内部质粒免受核酸酶的水解。该制备工艺制得的巯基化壳聚糖-pcDNA3.1(+)-EGFP纳米粒能将质粒DNA导入Hela细胞,使报告基因有效地表达,且对HeLa细胞无明显的细胞毒性。所以巯基化壳聚糖是在基因转运和基因治疗中有应用前途的非病毒类载体。


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