中药重楼中试提取工艺优选及抗肿瘤作用机制研究

【摘要】： 目的:以传统抗癌中药重楼为研究对象,优选最佳中试提取工艺,分离、纯化、精制得到抗肿瘤活性单体PCB5-9与PCB4—5,探讨重楼皂苷诱导人低分化胃腺癌SGC—7901细胞凋亡的作用机制,以期发现药物作用新靶点,为寻求治疗肿瘤的新方法奠定基础。 方法:(1)应用正交试验设计,以薯蓣皂苷元得率为考察指标,筛选重楼总皂苷的最佳提取工艺条件。以乙醇为提取溶剂提取得浸膏,浸膏水溶液依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得重楼总皂苷,然后分别经大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、反相ODS柱层析、RP-HPLC制备色谱制备得重楼皂苷单体成分。(2)采用MTT比色法研究中药重楼皂苷单体对肿瘤细胞株K562、SGC—7901体外增殖反应的抑制作用,确定其对体外培养的K562、SGC-7901细胞的作用剂量。(3)重楼皂苷单体经5(6)-TAMRA-5-maleimide荧光试剂标记后,MTT法观察重楼皂苷、荧光标记的重楼皂苷及游离荧光对SGC-7901细胞的抗肿瘤作用,并采用荧光显微镜评价该荧光标记药物的细胞染色情况。(4)琼脂糖凝胶电泳法观察重楼皂苷诱导肿瘤细胞SGC—7901凋亡的作用。(5)应用激光共聚焦显微术,以钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记SGC-7901细胞内钙离子,观察不同浓度的PCB5-9(83-93)作用于癌细胞10min后,药物对细胞内钙离子浓度动态变化的影响,并观察药物作用于细胞24h后,细胞内荧光强度的变化。 结果:(1)重楼皂苷的最佳提取工艺条件为乙醇浓度为70%,提取时间为5h,料液比为8倍,在此条件下从中提取,分离出重楼皂苷PCB 5-9(83-93)与PCB4-5(39-48),经进一步的分离纯化,经HPLC归一化方法鉴定其纯度分别为97.63%和91.80%,结构有待进一步的鉴定。(2)体外实验结果表明PCB 5-9、PCB4-5对肿瘤细胞株K562、SGC—7901均有抑制作用,其抑制率与时间、剂量呈依赖性关系。其中,PCB 5-9对K562、SGC—7901细胞的最高抑制率分别为88.54%和75.08%;72h的IC_(50)分别为6.55μg/mL与20.48μg/mL;PCB4-5最高抑制率为88.58%和75.68%;72h的IC_(50)分别为5.69μg/mL和4.83μg/mL。(3)荧光标记的重楼皂苷体外实验结果表明,标记后的重楼皂苷对SGC-7901细胞也具有抑制作用,浓度为0.03mmol/l时,抑制率为52.28%;游离荧光对肿瘤细胞没有抑制作用,荧光显微镜下观察标记的药物作用细胞2.5h后,细胞内出现红色荧光。(4)琼脂糖凝胶电泳结果显示从PCB 5-9(83-93)处理24h的SGC-7901细胞中提取的DNA,出现较典型的梯状电泳条带,且随着药物浓度的升高,条带亮度增加,10μg/mL药物组和阳性药顺铂组条带亮度最高。(5)激光共聚焦显微观察结果表明不同浓度药物孵育SGC-7901细胞10min后,LSCM动态观察细胞内的钙离子,发现没有显著变化,而药物作用24h后,细胞内钙离子浓度显著升高,且[Ca~(2+)]i随着药物浓度的增加而升高。 结论:正交设计优化的重楼皂苷提取工艺条件可放大,适用于工业提取;重楼皂苷对体外培养的人白血病细胞K562和人低分化胃腺癌细胞株SGC-7901的生长有抑制作用,且呈明显的剂量与时间依赖性关系,并诱导SGC-7901细胞凋亡,细胞内Ca~(2+)浓度升高,提示药物可能通过钙和钙调蛋白途径诱导细胞凋亡;标记的重楼皂苷对SGC-7901具有抑制作用,且能透过细胞膜进入活细胞。