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高抗凝、可诱导再生小口径人工血管的研究

魏屹晗  
【摘要】: 目的血管疾病是世界上发病率最高的疾病之一,而血管移植术是其目前主要的治疗手段。临床上应用的血管移植术材料主要来源为自体血管、异体血管和人工材料。目前,大、中口径人工血管移植应用效果较好,而小口径移植血管(直径6mm)易发生吻合口内膜增生以及血栓形成,远期通畅率不理想。血管组织工程技术为血管移植术所需材料、特别是小口径血管,提供了新途径。但目前,构建小口径组织工程化血管仍不尽如人意,如在人工血管内壁种植血管内皮细胞周期较长,短期内不能形成完整内膜,无法满足临床需求,而且同样存在远期通畅率不理想等问题。为此本课题将新鲜牛心包用于体外实验研究,将猪来源小口径血管用于体内实验研究,应用组织工程中的脱细胞技术和化学交联技术进行预处理,再进行肝素结合以及负载生长因子等改性处理,以期短期高效地制备出具有抗凝血活性、可诱导自体内皮再生的小口径人工血管。 方法(一)材料前期处理:反复冻融+TritonX-100联合作用对新鲜牛心包膜进行脱细胞处理,行HE染色后光镜下观察脱细胞效果;采用碳化二亚胺(EDC)作为交联剂,交联脱细胞牛心包膜,并通过生物力学检测、体外胶原酶降解实验以及变性温度测试考察交联程度。(二)材料表面肝素化处理,采用三种途径负载肝素:(1)EDC共价键合肝素;(2)聚乙烯亚胺(PEI, MW=1800D, 10kD,20kD)离子结合肝素;(3) EDC-PEI共价-离子联合负载肝素,即在EDC共价键合肝素基础上再采用PEI离子结合肝素。采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)和红外光谱评价材料负载肝素情况,采用接触角测量仪评价材料表面的亲疏水性,检测肝素化材料的含水量,并通过溶血试验、血小板粘附实验、抗凝血时间、复钙时间及细胞毒性试验评价材料的血液相容性及细胞相容性。(三)肝素化材料负载血管内皮细胞生长因子(VEGF165)实验,分别考察EDC共价键合肝素、PEI离子结合肝素以及共价-离子联合肝素化材料对碘标记VEGF165(125I-VEGF165)的控制释放能力,并进行促血管内皮细胞增殖实验。(四)将筛选出的最佳肝素化方式运用到小口径异种血管的表面改性,通过对犬实施血管置换手术观察这种小口径异种血管的可行性。 结果(一)光镜下观察发现,材料中的细胞脱除彻底,细胞外基质形态良好,结构完整,排列有序,表明反复冻融+TritonX-100联合作用是一种有效、经济、快捷的脱细胞方法。脱细胞基质经EDC交联处理后,力学性能及变性温度较新鲜牛心包显著提高且具有良好的抗降解性能。 (二)PEI离子结合肝素量与结合层数呈正相关,可通过调节结合层数达到所需肝素量要求,而EDC共价键合肝素量为定值,与PEI离子结合肝素层数达到18层左右时的肝素量相当。此外,采用三种分子量的PEI分别进行离子结合15层肝素处理,含水量及接触角测试结果表明PEI1800D处理组含水能力和亲水性能均优于PEI10kD、PEI20kD处理组;溶血试验中,PEI1800D溶血率为2.66%,PEI10kD溶血率为5.02%,PEI20kD溶血率为5.58%,表明PEI1800D溶血试验合格。通过上述实验筛选出PEI1800D作为阳离子剂进行后续实验。分别对交联对照组、EDC共价键合肝素组、PEI1800D离子结合肝素组、EDC-PEI1800D联合负载肝素组进行溶血试验、血小板粘附、凝血时间、复钙时间测试,发现EDC共价键合肝素组溶血试验不合格;EDC-PEI1800D联合负载肝素组抗凝血效果最佳,经过长时间生理盐水浸泡(15d),该组抗凝血性能保持最好。细胞毒性试验中,PEI1800D离子结合肝素组为0.5级,EDC-PEI1800D联合负载肝素组为1.0级,细胞毒性试验合格,优于EDC共价键合肝素组的1.3级。 (三)肝素化材料对VEGF165控释实验结果显示,EDC共价键合肝素对VEGF165的控释力优于PEI1800D离子结合肝素组,验证了共价键合稳定性高于离子结合方式,因此,采用EDC-PEI联合负载肝素方式可以弥补单纯使用离子结合肝素稳定性差的缺点。内皮细胞增殖实验中,EDC-PEI1800D联合负载肝素结合VEGF165组促细胞增殖力最好。 (四)结合VEGF165的EDC-PEI1800D联合肝素化小口径血管移植后,短期观察通畅效果良好,需要进一步长期观察。 结论EDC-PEI1800D联合负载肝素结合VEGF165方式具有良好的抗凝血性、促血管内皮细胞增殖能力,同时具有一定的降解性能和适当的力学性能,制备周期短,冻干灭菌后可室温长期保存,为小口径人工血管尽快适应临床要求提供了新的血管制备途径。


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