吲哚胺2，3双加氧酶转染小鼠乳腺癌4T1细胞后的表达及作用

【摘要】： 目的： 通过建立小鼠乳腺癌模型研究吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2, 3-dioxygenase,IDO)在乳腺癌远处转移过程中发挥的作用及可能机制。 检测IDO转染小鼠乳腺癌4T1细胞后的表达和意义。检测转染后的4T1细胞对免疫系统的抑制作用,寻找二者之间的联系,并探讨其引起转移的可能机制。 方法： 1.建立4T1小鼠乳腺癌远处转移模型,半定量RT-PCR法、Western blot和免疫组化法检测未转移和转移小鼠肿瘤组织中IDO的表达情况。 2.通过转染携带IDO基因的目的质粒建立高表达IDO的小鼠乳腺癌4T1细胞系,半定量RT-PCR和Western blot检测转染后的4T1细胞中IDO的表达；转染后的4T1细胞与小鼠脾脏T细胞共孵育,流式细胞仪检测T细胞凋亡的比例；Western blot法检测共孵育后的T细胞Fas/FasL与Bcl-2/Bax基因的表达情况。 结果： 1.半定量RT-PCR法检测示4T1细胞不表达IDO, IFN-γ刺激也不能明显上调IDO的表达。 2.免疫组化法示发生转移小鼠乳腺原发癌[(12.40±5.15)%]和转移癌中[(14.28±6.46)%]IDO的阳性细胞指数均高于未发生转移小鼠乳腺癌组织[(3.16±1.63)%](P0.05),发生转移小鼠乳腺癌转移灶中IDO的表达水平高于原发癌,但没有统计学差异(P0.05)。半定量RT-PCR法和Western blot结果与免疫组化结果一致。 3.调取IDO基因编码序列(CDS)区域,克隆至pMD19-T simple载体中并测序后连入真核表达载体pIRES2-EGFP。BglⅡ/SalⅠ双酶切重组质粒pIRES2-EGFP-IDO,验证连接成功。 4.将IDO真核表达载体pIRES2-EGFP-IDO通过脂质体转染小鼠乳腺癌4T1细胞,以转染空质粒组为对照。半定量RT-PCR法和Western blot检测示转染目的基因后的4T1细胞系IDO有表达,而转染对照质粒后的4T1细胞系和未转染的4T1细胞系IDO无表达。 5.将脂转目的基因、对照质粒和未转染的4T1细胞分别与小鼠脾脏分离T细胞共孵育,同时留取未共孵育的T细胞作对照,流式细胞仪检测T细胞的凋亡率。共同培养48小时后,流式细胞仪检测结果显示与转染目的基因IDO的4T1细胞共培养的CD3+T细胞(pIRES2-IDO-4T1/T cells,以后均用此代指)凋亡率为(47.07±6.13)%；与对照质粒(pIRES2-EGFP-4T1/T cells,以后均用此代指)和未转染的4T1细胞(4T1-T cells,以后均用此代指)共培养后的凋亡率分别为(35.56±4.26)%和(32.41±6.38)%；而正常培养的CD3+T细胞(simple-T cells,106/mL,以后均用此代指)的凋亡率为(12.40±3.40)%。组间比较有统计学差异(P0.05),而pIRES2-EGFP-4T1/T cells和4T1-T cells的凋亡率无统计学差异(P0.05),pIRES2-IDO-4T1/T cells出现较为明显的细胞凋亡。 6.留取pIRES2-IDO-4T1/T cells、pIRES2-EGFP-4T1/T cells、4T1-T cells和simple-T cells这四组小鼠脾脏T细胞,分别检测其Fas/FasL与Bcl-2/Bax蛋白的表达情况。Western blot法检测结果显示Fas、FasL和Bax的蛋白表达在pIRES2-IDO-4T1/T cells、pIRES2-EGFP-4T1/T cells和4T1-T cells这三组T细胞中均有增加,其中pIRES2-IDO-4T1/T cells这一组表达高于其它组(P0.05),pIRES2-EGFP-4T1/T cells和4T1-T cells这两组组间比较无统计学差异(P0.05),simple-T cells这一组表达最低。而Bcl-2的蛋白表达在pIRES2-IDO-4T1/T cells、pIRES2-EGFP-4T1/T cells和4T1-T cells这三组T细胞中均有降低,其中pIRES2-IDO-4T1/T cells这一组表达低于其它组(P0.05), pIRES2-EGFP-4T1/T cells和4T1-T cells这两组组间比较无统计学差异(P0.05), simple-T cells这一组表达最高。 结论： 1.发生转移的乳腺原发癌和转移癌中IDO的表达水平均高于未发生转移乳腺癌,提示IDO在乳腺癌转移过程中发挥作用。 2.通过转染携带IDO基因的目的质粒建立高表达IDO的小鼠乳腺癌4T1细胞系,转染后的4T1细胞与小鼠脾脏T细胞共孵育后诱导其凋亡率升高,检测结果显示Fas、FasL和Bax的蛋白表达均明显升高,而Bcl-2的蛋白表达则明显降低,提示IDO可能通过内、外两条途径诱导T细胞凋亡,从而抑制免疫系统的功能,促进肿瘤转移。