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五肽化合物PLNPK对大鼠抗GBM肾炎的治疗作用及其作用机制的研究

周春雷  
【摘要】: 目的: 观察五肽化合物CMS010.26对大鼠抗肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)肾炎的治疗作用,并探讨其可能的作用机制。 方法: 1.提取大鼠GBM抗原,免疫家兔制备兔抗大鼠GBM抗血清,免疫球蛋白预免疫加尾静脉注射抗血清法建立大鼠抗GBM肾炎模型。 2.将抗GBM肾炎模型大鼠随机分为不同的处理组,包括PLNPK 200、400μg/kg/d剂量组和生理盐水组,另设正常对照组。观察PLNPK对肾炎模型大鼠24小时尿蛋白、血生化指标及肾指数的影响,同时应用HE病理染色、透射电镜和免疫荧光的方法,研究PLNPK对大鼠抗GBM肾炎是否具有治疗作用。 3.将给药一周后的各组大鼠的肾组织切片用CD68免疫组化染色的方法检测肾小球内聚集的巨噬细胞(macrophage, Mφ)的数量,观察PLNPK对大鼠抗GBM肾炎模型动物肾小球内Mφ聚集的影响。 4.提取各组大鼠的肾皮质内RNA和总蛋白,通过Real-Time PCR和Western Blot检测PLNPK对肾皮质内单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein, MCP-1)的表达水平的影响。 5.建立大鼠肾小球系膜细胞(mesangial, MC)体外培养体系,培养扩增大鼠系膜细胞系RMC。重组大鼠IL-1β刺激MC及RMC细胞,提取RNA和蛋白,通过Real-Time PCR和Western Blot检测PLNPK对MC及RMC中MCP-1表达的影响。 6.利用Western Blot检测PLNPK对MC及RMC细胞内p38促分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)磷酸化的影响。 结果: 1.从注射抗血清的第二天,模型组大鼠24小时尿蛋白持续升高,和正常对照组相比P0.01,抗血清注射两周后,肾小球内可见新月体形成,家兔异种抗体和大鼠自身抗体沿GBM呈线性沉积,表明该大鼠抗GBM肾炎模型成立。 2. PLNPK (200、400μg/kg/d)在给药2周后,能够降低肾炎模型大鼠24小时尿蛋白,6周后,能够升高血清总蛋白和白蛋白,降低血中尿素氮及胆固醇水平,但是对血清甘油三酯和肌酐水平的影响不明显。PLNPK可以降低肾指数,减少肾小球内新月体的形成数量。免疫荧光研究发现,200和400μg/kg/d的PLNPK可以明显减少肾小球基底膜自身抗体的沉积,透射电镜结果显示,PLNPK可以降低肾小球基底膜增厚和足细胞足突融合的程度。 3.大鼠抗GBM肾炎模型建立一周后,生理盐水组肾小球内可见大量Mφ聚集,正常对照组大鼠肾小球内未见Mφ。给予PLNPK (200、400μg/kg/d)治疗一周后,肾小球内Mφ聚集的数量明显减少,和生理盐水组相比P0.01。 4.大鼠抗GBM肾炎模型建立一周后,生理盐水组肾皮质内MCP-1 mRNA转录水平和蛋白表达水平明显高于正常对照组,P0.01。给予PLNPK (200. 400μg/kg/d)治疗一周后,肾皮质内MCP-1 mRNA转录水平和蛋白的表达水平明显降低,和生理盐水组相比P0.01。 5.MC细胞和RMC细胞在受到大鼠IL-1β刺激作用5小时,MCP-1 mRNA转录水平明显升高,接受刺激12小时后,MCP-1蛋白水平已明显升高,PLNPK (1.6、3.2、6.4mg/ml)对于MC和RMC两种细胞MCP-1 mRNA转录和蛋白的表达均有明显的抑制作用,和IL-1β刺激组相比P0.01。 6.MC细胞和RMC细胞在受到大鼠IL-1β刺激作用30minsp38 MAPK的磷酸化水平明显升高,用PLNPK (1.6、3.2、6.4mg/ml)预处理能够抑制MC和RMC两种细胞接受IL-1β刺激作用后p38 MAPK的磷酸化,和IL-1β刺激组相比P0.01。 结论:PLNPK对大鼠抗GBM肾炎具有治疗作用,其可能的机制是:通过抑制大鼠肾小球系膜细胞p38 MAPK的磷酸化,从而抑制肾小球系膜细胞的活化,降低MCP-1的表达,进而减少肾小球内Mφ的聚集,减轻肾组织的损伤程度。


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