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酪丝缬肽对多药耐药肿瘤细胞耐药性的逆转作用及其机制研究

石琳熙  
【摘要】: 目的: 研究三肽化合物酪丝缬肽(Tyroservatide,YSV)对多药耐药肿瘤细胞耐药性的体外逆转作用,并初步探讨其可能的作用机制。 方法: 1.应用MTS法观察人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU及人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(DOX)、长春新碱(VCR)的交叉耐药性。 2.‘以人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU及人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR为研究对象,应用MTS法观察YSV对细胞增殖的抑制作用;选择低细胞毒作用的YSV剂量,研究其对细胞耐药性的体外逆转作用。 3.应用流式细胞术观察YSV对多药耐药细胞BEL-7402/5-FU、MCF-7/ADR细胞内阿霉素、罗丹明123蓄积量的影响。 4.应用实时荧光定量PCR、Western Blot方法,观察YSV对耐药细胞BEL-7402/5-FU、MCF-7/ADR细胞中耐药基因MDR1 mRNA及其蛋白产物P-gp表达的影响;并进一步观察YSV对MDR1的调控因子PKCa蛋白表达的影响。 5.应用实时荧光定量PCR、Western Blot方法,观察YSV对多药耐药细胞BEL-7402/5-FU、MCF-7/ADR细胞中其它耐药相关基因MRP1、LRP、GST-πmRNA及其蛋白表达的影响。 6应用流式细胞术和DNA Ladder检测方法研究人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU其耐药性与凋亡受抑之间的关系;观察YSV与化疗药物合用时对BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响。 7.应用Western Blot方法,观察YSV对人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU细胞中凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xL及抑癌基因P53蛋白表达的影响。 结果: 1.人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU对5-FU及DOX的耐药倍数分别为287.39、5.89倍,人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR对DOX及VCR的耐药倍数分别为18.74、8.08倍。 2. YSV (0.1-1.6mg/ml)对多药耐药肿瘤细胞BEL-7402/5-FU及MCF-7/ADR的增殖具有剂量依赖性抑制作用趋势。对于BEL-7402/5-FU细胞,0.8mg/ml以下浓度为低细胞毒剂量;对于MCF-7/ADR细胞,1.6mg/ml以下浓度为低细胞毒剂量。 3. YSV (0.4、0.8mg/ml)在体外能够部分逆转人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU对5-FU、DOX的耐受性;YSV (0.8、1.6mg/ml)在体外能够部分逆转人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR对DOX、VCR的耐受性。 4.YSV可显著增加多药耐药细胞BEL-7402/5-FU及MCF-7/ADR细胞内阿霉素、罗丹明123的蓄积量。 5.YSV可显著抑制多药耐药细胞BEL-7402/5-FU及MCF-7/ADR细胞内多药耐药基因MDR1的mRNA及其蛋白产物P-gp的表达,同时抑制MDR1的调控因子PKCa的蛋白表达;YSV可显著抑制BEL-7402/5-FU及MCF-7/ADR细胞内其它耐药相关基因LRP. GST-π的mRNA及蛋白表达,降低MRP1蛋白水平。 6.流式细胞术结果表明,与其亲本细胞BEL-7402相比,耐药细胞BEL-7402/5-FU能够显著抵抗5-FU的诱导凋亡作用;YSV (0.4、0.8mg/ml)与5-FU联用后,人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU的凋亡细胞数量显著增加,并形成明显的DNAladder。 7.YSV可抑制人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU细胞内抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达,促进抑癌基因P53的蛋白表达。 结论: YSV可有效逆转耐药肿瘤细胞BEL-7402/5-FU及MCF-7/ADR对化疗药物的耐受性,部分恢复细胞对化疗药物的敏感性。YSV逆转耐药的作用机制可能是与抑制耐药蛋白P-gp的基因表达及其药物外泵功能,抑制MRP1、LRP、GST-π等耐药相关基因的表达,下调抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL表达,上调抑癌基因P53表达,促进化疗药物诱导的耐药细胞凋亡有关。


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