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泛素—蛋白酶体途径在TRAIL诱导恶性淋巴瘤凋亡抵抗中的作用

赵天锁  
【摘要】: 目的:恶性淋巴瘤发病率居我国恶性肿瘤第八位,平均死亡年龄49.9岁,是严重危及儿童和青少年的恶性肿瘤。目前化疗是治疗恶性淋巴瘤的主要手段之一,因此如何筛选出有效的化疗药物,并且提高敏感性、克服耐药性是当前急需解决的问题。 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)是近年发现的具有选择性诱导肿瘤细胞,转化细胞和病毒感染细胞凋亡而对正常细胞没有毒性的肿瘤坏死因子家族成员。在Ⅰ型细胞,活化的procaspase-8和procaspase-10通常直接触发caspase依赖的凋亡信号转导途径而导致细胞凋亡。但在Ⅱ型细胞,需要通过线粒体依赖的信号传导途径而导致细胞凋亡。目前研究表明TRAIL可以诱导许多恶性肿瘤细胞凋亡,但几乎不引起正常细胞凋亡,因此TRAIL被认为是一种有希望的恶性肿瘤治疗药物。然而相当一部分肿瘤细胞,特别是一些高度恶性肿瘤表现出对TRAIL的原发性或继发性耐药。阐述这类肿瘤细胞的耐药机制对于有效的使用TRAIL具有重要意义。在细胞凋亡通路中任何关键节点的功能失调都会导致细胞耐药的产生。 众所周知,细胞凋亡过程是复杂的生物调控过程,主要是通过死亡受体途径和线粒体途径来介导,两者之间相互交叉,又能相互扩大来自对方的死亡信号,其中线粒体含有的多种成分如SMAC,细胞色素c更是对凋亡起着重要的调节作用,因此我们认为通过扩大或放大线粒体信号通路,也许能够有效逆转细胞耐药。线粒体的稳定性与Bcl-2家族蛋白有着极大的关联,这个家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两大类:前者包括Bax、Bak、Bid、Bad等,而后者包括Bcl-2、Bcl-XL等,两类蛋白的比例直接影响线粒体的稳定性,从而触发或抑制凋亡过程。其中Bax是一种重要的促凋亡蛋白。 蛋白的翻译后修饰是决定蛋白表达水平的一个重要因素。所有机体组织细胞中都存在溶酶体途径、calpain系统、泛素-蛋白酶体途径和泛素非依赖性等多种蛋白降解途径,其中泛素-蛋白酶体途径作用范围非常广泛。泛素化的蛋白质可以通过泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)降解。总之,通过我们的前期工作发现细胞中促凋亡蛋白Bax表达水平下降是药物治疗肿瘤过程中的一个频发事件,可能与肿瘤的药物抵抗密切相关。 本实验的研究目的是通过泛素-蛋白酶体途径对促凋亡蛋白Bax表达调控机制的研究,探讨在泛素调节下Bax水平、构象、位置的变化,拟从整体角度阐述泛素-蛋白酶体系统对细胞内关键蛋白的调节作用,为治疗提供新的靶点。 方法: 一、研究TRAIL诱导恶性淋巴瘤细胞凋亡情况 1.细胞培养及处理:本研究选择B型恶性淋巴瘤细胞Raji、U937和人B淋巴母细胞Hmy2.ciR为研究对象。细胞经RPMI1640培养基常规传代培养,待细胞生长至对数生长期时,使用浓度为500ng/ml TRAIL处理细胞 2.细胞凋亡检测:分别采用500ng/mlTRAIL处理各组细胞,于0、6、24h不同时点收集2m1处理后的细胞,离心洗涤后经碘化丙锭(PI)和AnnexinV-FITC染色,采用流式细胞仪检测细胞凋亡 3.细胞凋亡中caspase-8、9酶活性测定:500ng/mlTRAIL处理各组细胞后,于0、6、24h不同时点收集10ml处理后的细胞,离心处理后加入caspase-8、9荧光底物30℃水浴15min,加入1%的醋酸钠终止反应。用TD-700荧光光度计在400/505nm反应所释放的荧光 4.采用MTT法绘制细胞生长曲线:收集细胞按照每孔1×104个细胞设3个复孔,500ng/mlTRAIL处理各组细胞后,分别于0、2、4、6、8、24h取出细胞进行MTT检测,绘制细胞生长曲线 二、研究TRAIL诱导恶性淋巴瘤细胞凋亡过程中Bax表达情况 1.静息状态下细胞内源性Bax蛋白的表达水平和稳定性:静息状态下收集细胞提取蛋白,western-blot检测Bax蛋白的表达情况 2.采用western-blot检测TRAIL处理后细胞Bax蛋白表达水平及活性状态 3.采用RT-PCR检测TRAIL处理后细胞Bax基因表达水平 4.采用细胞亚结构分离技术和western-blot观察TRAIL处理后Bax在细胞内定位情况 三、研究泛素-蛋白酶体途径对细胞内Bax蛋白表达变化的调节作用 1.泛素-蛋白酶体途径在TRAIL作用过程中对Bax的调节作用,采用免疫共沉淀和western-blot检测TRAIL作用过程中Bax和泛素结合情况 2.在体外状态下模拟泛素-蛋白酶体途径对Bax蛋白的调节作用 四、蛋白酶体抑制剂对恶性淋巴瘤耐药机制的调节作用 1.蛋白酶体抑制剂和TRAIL协同诱导恶性淋巴瘤凋亡的情况 2.蛋白酶体抑制剂对Bax蛋白表达水平的调节作用 结果:500ng/ml的TRAIL体外处理恶性淋巴瘤细胞Raji、U937,发现24小时后此两种细胞的凋亡率明显低于正常对照细胞Hmy2.ciR, Western-blot检测发现TRAIL处理淋巴瘤细胞24小时后Bax蛋白表达水平呈明显的下降趋势;而同时RT-PCR检测三种细胞的Bax mRNA表达水平却未见差异性改变;当TRAIL和泛素-蛋白酶体抑制剂PS-341合用后可明显逆转恶性淋巴瘤细胞Raji、U937对TRAIL的耐药情况,细胞凋亡率增加,同时Bax蛋白的表达水平也呈逐渐增加的趋势;采用细胞亚结构分离技术发现TRAIL作用后淋巴瘤细胞Raji、U937的细胞浆、线粒体Bax蛋白表达逐渐减少,而细胞核的Bax蛋白未发生明显变化,TRAIL与蛋白酶体抑制剂PS-341合用后Raji、U937的细胞浆、线粒体Bax蛋白表达逐渐增加,细胞核Bax蛋白仍未发生明显变化;TRAIL作用细胞后Raji、U937的Ubiquitin蛋白表达逐渐增加;免疫沉淀技术发现当TRAIL处理细胞6小时后,发生泛素化的Bax蛋白水平明显增加;加入外源性ubiquitin (2μg/ml)后,淋巴瘤组织的Bax蛋白量逐渐减少,而癌旁组织的Bax蛋白量却未见明显变化。 结论:恶性淋巴瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡,出现较明显的耐药性和促凋亡蛋白Bax表达下降,这是蛋白翻译后修饰所致;泛素-蛋白酶体途径调控促凋亡蛋白Bax的表达,蛋白酶体抑制剂PS-341与TRAIL合用后可逆转细胞的药物抵抗,使得促凋亡蛋白Bax的表达量增加,可促进细胞凋亡,有效改善治疗效果及预后,这可能为临床提供了新的治疗靶点。


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