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C3转移酶联合雪旺细胞修复脊髓损伤的实验研究

李辉  
【摘要】: 目的 探讨C3转移酶联合雪旺细胞(schwann cells, SCs)尾静脉移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的疗效。 方法 SPF级雌性Wistar大鼠,体重50±10g,脱颈处死后取双侧坐骨神经,显微镜下抽出神经束,采用植块法培养、传代、纯化,S-100染色鉴定雪旺细胞,移植前一天用Hoechst33342标记雪旺细胞。SPF级Wistar雌性大鼠60只,体重220±10g,利用Impactor model-Ⅱ打击仪垂直打击(10g×25 min),建立胸10(T10)脊髓损伤模型,造模成功后随机分为4组:单纯DMEM空白对照组(A组)、单纯C3移植组(B组)、单纯雪旺细胞移植组(C组)C3联合雪旺细胞移植组(D组);单纯DMEM空白对照组(A组):损伤后1周尾静脉注射DMEM 1ml;单纯C3移植组(B组):损伤后立即和术后3天分别局部注射C3转移酶10μl;单纯雪旺细胞移植组(C组):损伤后1周尾静脉移植雪旺细胞1ml(1×106);C3联合雪旺细胞移植组(D组):损伤后立即和术后3天局部分别注射C3转移酶10μl,损伤后1周尾静脉移植雪旺细胞1ml(1×106)。术前1d、术后1d、3d、1w及以后每周进行BBB评分、脚印分析行为学评价损伤后大鼠后肢功能恢复情况。细胞移植后1、2、4周各组分别取材行冰冻切片观察移植细胞的迁移情况。损伤后12周行葡聚糖胺(biotin-dextran amine, BDA)顺行示踪皮质脊髓束,2周后取出实验动物损伤段脊髓,行快速冰冻切片观察神经纤维再生情况。移植后13周取材行常规HE染色,免疫荧光染色观察损伤段神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达。 结果 组织块培养第3天见少量雪旺细胞迁出,1周后可见植块周边有大量细胞迁出,经纯化、S-100染色鉴定,获得雪旺细胞的纯度达95%。移植后1、2、4周损伤段及邻近节段脊髓内可观察到Hoechst33342阳性细胞。术前所有实验动物双后肢BBB评分均为21分,术后1、3d BBB评分0-1分,随后BBB评分逐渐上升,至损伤后13周实验结束时D组最高评分达13分左右。术后第4周C、D组与A组比较差异有统计学意义(p0.05),第5周各组组间差异均有统计学意义(p0.05);术后9周B、C、D组组间脚印分析结果差异有统计学意义(p0.05)。HE染色示损伤后2周时各组均有空洞形成,B、C、D组损伤区空洞面积小于A组。免疫荧光染色示,A组GFAP反应最强,损伤区空洞明显可见,范围大于其它三组,D组GFAP阳性面积明显小于其它实验组(p0.05);B、C、D组NSE阳性面积与A组比较差异均有统计学意义(p0.05);C组和D组脊髓损伤区及其远端可见BDA标记的神经纤维通过损伤区域。 结论 静脉移植的雪旺细胞能够通过血脊髓屏障向脊髓损伤区域迁移,C3转移酶可以改善损伤局部微环境,C3转移酶联合雪旺细胞移植,能够促进受损神经纤维的修复和再生,对大鼠脊髓损伤的修复有较好的疗效。


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