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牵张成骨矫治猕猴腭部软硬组织缺损基因及细胞因子表达研究

刘延山  
【摘要】: 目的 以牵张成骨术整复猕猴腭部软硬组织缺损,定量分析新骨在不同时期胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),骨桥蛋白(osteopotin, OPN)与骨钙蛋白(osteocalcin,OC)的表达水平,探讨新骨生成与改建的规律。 方法 1.以猕猴为对象建立腭裂动物模型。实验组动物21只行牵张成骨术整复其腭部软硬组织缺损,关闭裂隙后固定。固定期第1、2、4、6、8、12及24周分别取材,各3只动物。采用实时定量PCR法(real-time, RT-PCR)定量比较IGF-Ⅰ, ALP, OPN与OC的mRNA表达水平并以酶联免疫吸附试验法(ELISA)定量分析相应细胞因子含量,并与实验对照及实验对照组(各2只动物)结果进行比较。 2.为了深入了解这IGF-Ⅰ, ALP, OPN与OC在牵张成骨中的相互作用机制,将4个基因mRNA和相应因子的蛋白分子表达量用Pearson积矩法进行相关性分析,计算其相关系数r。 结果 1.固定期第1-2周为成骨早期,第1周时IGF-Ⅰ和ALP的mRNA表达明显上调,分别为3.67±0.35和3.30±0.21,第2周时达最高峰,分别为7.55±0.32和5.91±0.21,随后逐渐下降,至第12周与实验对照组无明显差异(P0.05)。ELISA结果显示:固定期第1-2周,IGF-Ⅰ和ALP表达均增强。IGF-Ⅰ含量于第2周表达最高,为(2.0±0.06)ng/mg,第4周为(1.46±0.08)ng/mg,第6周为(0.84±0.11)ng/mg,其表达逐渐下降;同期ALP则呈高水平表达,第4周为(25.34±0.44)U/mg,第6周为(26.21±0.82)U/mg。第8-12周,IGF-Ⅰ和ALP的表达均下降至接近实验对照组。 2.固定期第2周OPN mRNA表达上调,第4周达最高(7.59±0.37);而OC mRNA表达则自第4周开始上调(4.98±0.21),第6周时达最大值(7.94±0.31)。随后开始下降,至第24周时两者的mRNA表达水平接近实验对照组(P0.05)。ELISA结果显示:固定期第4、6周OPN分别为(4.75±0.15)ng/mg和(4.86±0.09)ng/mg, OC分别为(3.18±0.16)ng/mg和(3.63±0.33)ng/mg,两者均为高水平表达。至第8-12周以后蛋白表达趋势与其对应mRNA表达基本一致。 3. IGF-Ⅰ与ALP (r=0.88546), IGF-Ⅰ与OPN (r=0.65549),在mRNA表达水平上具有显著的正相关性,而OPN与ALP (r=0.82380), OPN与OC(r=0.74945)在mRNA表达水平上也具有显著的正相关性,三者之间可能存在相互调控机制;在蛋白分子表达水平方面,IGF-Ⅰ与ALP(r=0.68922), IGF-Ⅰ与OPN (i=0.68541),在分子表达水平上具有正相关性,而OPN与ALP (r=0.99468), OPN与OC (r=0.0.88352), ALP与OC(r=0.88352)在表达水平上具有显著的正相关性,亦可能存在相互调控机制。 结论 1.腭骨牵张成骨区域,新骨的原位增量生成明确,增殖过程正常,最终以膜内成骨的方式形成新骨整复了腭裂骨切开牵张间隙区域。 2. IGF-Ⅰ与ALP, IGF-Ⅰ与OPN, OPN与ALP在mRNA和蛋白水平上均呈现显著正相关性,具有一致性,表明IGF-Ⅰ与ALP, IGF-Ⅰ与OPN以及OPN与ALP之间可能存在一种正向调控机制。 3.纵观本研究不同实验时间间期,IGF-Ⅰ, ALP, OPN, OC的mRNA表达水平与蛋白合成表达二者的变化曲线具有一致的对应变化趋势。通过其各自mRNA水平的定量测定和蛋白水平定量测定,从分子和基因层面,相互印证阐释了牵张成骨矫治腭裂及腭部获得性骨质缺损术式的各个阶段,细胞功能活动状态和细胞外基质结构成分的改变趋势与特征:IGF-Ⅰ, ALP在成骨早期即显著高表达,在骨基质矿化阶段有所降低;而OPN是最早合成的基质蛋白于成骨中后期表达高效;在实验分组后期阶段则OC和细胞外基质钙化同时出现。


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