S100A蛋白在角膜新生血管中的实验研究

【摘要】：目的S100A蛋白家族主要参与多种炎症的病理过程,其中的部分成员还可能参与肿瘤、新生血管等病理过程的发生、发展。本课题旨在研究S100A8/9蛋白是否参与炎症相关性角膜新生血管(CorNV)的发病过程,并进一步通过诱导形成新生血管的体外及体内模型,探讨S100A8/9蛋白在其中的变化规律及作用机制。 方法我们用10-0尼龙缝线或化学烧伤的方法在Balb/c或C57B1/6小鼠角膜诱导两种CorNV模型,进行基因表达谱的芯片分析。在缝线术后不同的时间点,取材做病理切片来检测角膜基质部炎性细胞的浸润情况。应用实时定量PCR(RT-QPCR)的方法对部分有代表性的基因进行验证性的测定,包括S100A家族中(S100A4、S100A6、S100A8、S100A9和S100A13),促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、转化生长因子β1和MIP-2),以及促血管生成因子(成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子)。用免疫荧光的方法检测长有新生血管的角膜中中性粒细胞或巨噬细胞浸润以及S100A8或S100A9蛋白的表达。在小鼠体内实施抗体介导的中性粒细胞或S100A8中和的实验能够有效证明中性粒细胞和S100A蛋白在缝线诱导角膜新生血管模型(S-CorNV)中发挥的作用。体外观察S100A8/9蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)增殖、成管、迁移能力的作用。体内采用Matrigel皮下注射的方法,通过对血红蛋白定量和HE组织切片的比较,从而验证S100A8/9蛋白对新生血管的促生长变化。 结果基因芯片分析显示,与正常小鼠相比,两种CorNV模型中的S100A4、S100A6、S100A8、S100A9和S100A13基因都有所上调,其中,S100A8和S100A9的变化最为显著。RT-QPCR检测结果表明在S-CorNV模型角膜中S100A和细胞因子表达的变化具有时间依赖性,在术后第5天达到顶点。免疫荧光显示角膜中的中性粒细胞和巨噬细胞能够分泌S100A8和S100A9蛋白。在诱导S-CorNV模型前一天进行中性粒细胞清除可以减轻发病的严重程度,并且减少了角膜新生血管中S100A8/9蛋白的产生,同时S100A基因和促炎症或促血管生成的基因上调的程度也有所降低。另外结膜下注射S100A8抗体也显着抑制S-CorNV模型中血管的生长和炎症的发展。在MTT实验中,与对照组相比S100A8/9蛋白在10ug/ml的浓度下可促进HUVEC细胞的增殖、迁移和成管。与单独应用Matrigel对照组比较,皮下注射含有S100A8/9蛋白的Matrigel中的新生血管生长明显,其中的血红蛋白含量高,局部浸润的炎性细胞较多,从而证明S100A8/9蛋白在体内能够促进新生血管的形成。 结论S100A蛋白参与了炎症性角膜新生血管的发病过程,尤其是S100A8或S100A9蛋白有可能作为有效控制该疾病病理过程的靶蛋白。同时,体内体外的实验也证明S100A8/9蛋白参与新生血管的形成过程,可能是通过直接作用于血管内皮细胞而实现的。