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肝细胞生长因子在牵张成骨(DO)过程中表达的实验研究

董刚  
【摘要】:目的1.牵张成骨(distraction osteogenesis, DO)也称作牵引成骨,是近年来发展起来的一项颇有价值的临床技术,有着较大的临床应用的潜力,同时为我们研究骨组织再生的基本机理开辟了新的途径。基础理论研究离不开良好的动物模型的建立,本实验将用兔建立下颌牵张成骨实验动物模型,探讨建立一种可行性及可重复性强的下颌牵张成骨动物模型的方法。 2.肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)又称为扩散因子,最早是从血浆及血小板中纯化获得,它被认为是一种能刺激肝细胞生长增生的有丝分裂原,对肝切除和化学损伤后肝的再生起重要作用。HGF同时又是一种具有比较强的诱导血管生成作用的细胞因子,和其他促血管生成因子如VEGF,bFGF等类似,可以加强内皮细胞在模拟血管生成的微环境内形成管状结构的能力。本实验将在已建立的兔下颌牵张成骨动物模型的基础上,研究HGF在下颌DO过程中的表达及分布规律,探讨其在下颌DO过程中的作用和机理,以求寻找一种缩短DO疗程的新途径。 方法 一:选用16只成年新西兰大白兔,体重分布在3.3~3.5kg。全麻条件下,沿下颌骨下缘将皮肤切开,分离软组织及骨膜,暴露出骨面。在生理盐水冲洗降温的条件下,用金刚砂片于下颌第一前磨牙前约1 mm处无牙区行皮质骨切开术,切开颊侧及下颌下缘皮质骨,以薄骨凿插入裂隙将下颌体折断,造成人为骨折。操作时注意保护好骨膜、骨髓及下牙槽血管。充分止血后,将骨段以自制骨支持式口外下颌双侧牵张器固定,分层缝合,严密关闭创口。术后骨段原位固定7d(间歇期),从第8d开始以0.25mm/6h的速度进行牵张,连续7d(牵张期),然后固定(固定期)。分别在间歇期末、牵张结束、固定期第14d、28d,随机处死4只动物。取大体标本进行观察,并通过X线和组织学方法检查牵张区新骨形成的情况,探讨模型建立的方法。 二:选用成年新西兰大白兔44只,随机分为三组。分别为牵张组、骨折对照组和正常对照组,各20、20、4只动物。牵张组按前述方法建立下颌牵张成骨动物模型并进行牵张;骨折对照组用相同方法造成下颌骨骨折并用牵张器固定,但是不进行牵张;正常对照组取正常下颌骨组织作为对照。于不同时期处死动物,标本行免疫组织化学(immunohistochemical, IHC)染色,观察HGF的表达及分布情况。采用半定量法对组织切片着色强度分级评分,结果采用SPSS10.0软件包进行统计学处理。 结果 一:全部实验动物的下颌骨被成功延长,X线检查见牵张间隙逐渐由新生骨组织充填。组织学切片观察:间歇期末,裂隙近远中骨皮质为骨痂覆盖,可见扩张的新生毛细血管及软骨样组织形成;牵张结束,间隙内充满沿牵张方向排列的大量新生毛细血管及成纤维细胞,胶原纤维周围、皮质骨断端和骨髓腔附近有新骨形成,新生骨小梁表面有肥大的成骨细胞;固定期第14d,牵张区骨小梁数量增多,纤维成分减少,骨小梁多数沿牵张方向平行排列,部分交织成网并出现钙化,其间有大量新生血管,成骨细胞在新生骨小梁表面排成一层,成骨活跃;固定第28d,裂隙中央出现钙化的骨小梁,周围新生骨小梁粗大,连接成片,原骨断端附近,不成熟的骨小梁消失,新生骨在结构上已近似于原先成熟的骨质。牵张过程中间隙内新骨形成方式以膜内成骨为主,动物模型在组织学上与相关报道吻合。 二:牵张及骨折组HGF表达增加,阳性着色主要定位于内皮细胞胞膜和胞浆;破骨细胞表达HGF仅出现于术后1w左右;正常对照组骨组织无阳性着色。牵张及骨折组HGF表达在术后1w开始增加,术后2~3w时达到最强,随后表达强度下降,至术后7w时,两组IHC染色为阴性。牵张组较骨折组HGF的表达强度大,持续时间长。 结论1.本实验成功建立了兔下颌牵张成骨动物模型,它能够较好的反映下颌牵张成骨过程中在不同时期牵张间隙内新生组织的生理及病理学变化,可重复性较强。该模型可在动物下颌骨两侧施以不同干预方式,即能够利用同一动物研究两种不同基因或生物活性物质对牵张成骨的影响,进行对照,可更好的满足当前研究的需要,增加了实验数据的可靠性,这对于进一步深入研究牵张成骨的生物学机制,提高实验研究效率具有重要的实用价值。 2.DO和骨折过程中间充质细胞和血管壁细胞细胞均表达HGF,而DO过程中HGF表达较强。HGF通过促进血管形成,在保证局部供养、促进骨再生方面具有重要作用。牵张成骨过程中,间隙内张力的存在可能对HGF的表达具有增强作用。


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