Ndfip1介导的DMT1降解在6-OHDA诱导的多巴胺能细胞铁聚集中的作用

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,以肌僵直、静止性震颤和姿势反射障碍为主要临床表现,其主要病理特征为黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元进行性缺失和残存的神经元内路易小体(Lewy body, LB)的出现。PD的病因迄今未明,发病机制十分复杂。近年来,已有大量证据表明黑质(substantia nigra, SN)铁聚集在PD的发病中起到关键作用,其机制可能与某些铁转运蛋白的表达调控异常有关。二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter1, DMT1)是跨膜的铁转入蛋白,在PD病人及动物模型中均发现黑质DMT1的表达增高,提示DMT1可能与PD SN的铁聚集有关。 Ndfip1蛋白,又称之为N4WBP5蛋白,是一种衔接蛋白,可以与Nedd4家族蛋白结合,介导蛋白的泛素化降解。已有报道Ndfip1介导的蛋白降解在神经元损伤后的细胞存活中具有重要的作用。近年研究发现Ndfip1能够降解人类皮层神经元的DMT1从而参与调节机体的铁稳态。但是Ndfip1在PD的铁聚集中是否有作用及其机制仍不清楚。本实验应用实时荧光定量PCR、Western blots、激光扫描共聚焦显微镜技术、流式细胞术等技术研究了Ndfip1在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)处理的MES23.5多巴胺能细胞铁聚集中的作用,并深入讨论其机制。结果如下： 1.6-OHDA单侧损毁大鼠21d后,SN Ndfip1的蛋白表达降低(P0.05,与对照组相比)。2.10μmol/L6-OHDA处理MES23.5细胞,细胞内Ndfip1mRNA及蛋白水平降低(P0.05,与对照组相比)。 3. pCMV6-XL5-Ndfip1转染MES23.5细胞后,细胞内Ndfip1蛋白水平较对照组明显增加,而高表达Ndfip1可以明显降低细胞内DMT1(+IRE)的蛋白水平(P0.01,与对照组相比)。 4.10μmol/L6-OHDA处理MES23.5细胞24h,DMT1(+IRE)蛋白表达水平较对照组明显增加(P0.05,与对照组相比)；高表达Ndfip1可明显降低由6-OHDA引起的DMT1(+IRE)蛋白水平的上调(P0.05,与6-OHDA处理组相比)。 5.10μmol/L6-OHDA处理MES23.5细胞24h,细胞的铁摄取功能与对照组相比明显增强(P0.01,与对照组相比)；而高表达Ndfip1可以减少6-OHDA诱导的细胞摄取功能的增加(P0.01,与6-OHDA处理组相比)。 6.100μmol/L Fe2+孵育MES23.5细胞4h,细胞内活性氧物质(reactive oxide species, ROS)与对照组相比生成增加,细胞的线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential, ΔΨm)与对照组相比降低(P0.01,与对照组相比)；而高表达Ndfip1可以抑制铁诱导的ROS的生成及△Ψm的降低(P0.05,与铁孵育组相比)。 7.10μmol/L6-OHDA处理MES23.5细胞24h后给予100μmol/LFe2+孵育4h,细胞内ROS与对照组相比生成增加,△Ψm降低(P0.05,与铁孵育组相比)；而高表达Ndfip1可抑制ROS的生成(P0.05,与6-OHDA处理/铁孵育组相比)及△Ψm的降低(P0.01,与6-OHDA处理/铁孵育组相比) 上述结果表明,Ndfip1在6-OHDA诱导的PD大鼠模型及6-OHDA处理的MES23.5细胞中的表达均降低；高表达Ndfip1可以通过泛素-蛋白酶体途径介导铁转入蛋白DMT1(+IRE)的降解,降低6-OHDA处理的MES23.5细胞DMT1(+IRE)的蛋白水平,降低细胞的铁摄取,从而进一步抑制铁诱导的活性氧物质的生成以及△Ψm的降低,对细胞起到保护作用。本研究将为DMT1和Ndfip1相互作用参与PD发病提供新的依据,并为药物干预提供可能的作用靶点。硕士研究生：贾文婷(生理学)指导教师：谢俊霞教授