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K_(ATP)通道的激活对多巴胺能细胞铁转运功能的影响及其在PD中的作用研究

杜希恂  
【摘要】:铁是一切生命体都必不可少的微量金属元素之一,体内铁稳态的维持对于机体的正常生理功能是必需的。但是,过量的铁却可以通过Fenton反应与体内H202作用,产生具有高度活性的羟自由基(hydroxyl,·OH),后者作用于蛋白质、核酸和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜,从而引起细胞损伤。近年来的研究发现,帕金森病(Parkinson's disease, PD)病人脑内黑质(substantia nigra, SN)铁含量显著增高。PD是一种常见的神经系统退行性疾病,其病理特征是中脑黑质致密带(substantia nigra pars compact, SNpc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元缺失,从而导致其释放到纹状体的DA减少,引起静止性震颤,肌僵直,姿势反射障碍等临床表现。PD的发病机制至今仍不是十分清楚,可能与遗传、环境、氧化应激、炎症反应、SN内铁聚集以及细胞凋亡等多种因素有关。由于铁的细胞毒性以及产生自由基的能力,铁的选择性聚集成为SN DA能神经元变性死亡的一个关键因素。 在脑内,DA能神经元聚集的部位主要存在于SN,腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)和弓状核(arcuate nucleus)。但是,在PD中,SN区DA能神经元选择性损伤,而VTA的DA能神经元却几乎不受影响,其机制到目前为止还不是十分清楚。2005年发表在Nature Neuroscience上的研究表明,SN DA能神经元的选择性损伤的机制可能与SN区ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channels, KATP)的选择性激活有关。细胞内ATP水平的降低或氧化应激等均可导致KATP通道的激活,引起细胞膜的超极化。本实验室的前期工作与其他研究者的工作已经证实了二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter 1, DMT1)在PD SN铁聚集中的重要作用。而DMT1的铁摄取功能除与蛋白质的表达量有关外,还依赖于pH值,温度,膜电位水平等,如细胞膜的超极化可以增强DMT1的摄铁功能。但是KATP通道的激活导致的细胞膜的超极化在DMT1介导的铁聚集中的作用尚不清楚,因此,本实验应用细胞培养、全细胞膜片钳技术、分子生物学技术、免疫荧光、RT-PCR,免疫印迹等技术方法,观察了KATP通道的激活对多巴胺能细胞由DMT1介导的摄铁功能的影响,并进一步探讨其在PD中的作用。结果如下: 1、应用DiBAC4(3),观察KATP通道开放剂diazoxide对SK-N-SH细胞膜电位的影响,diazoxide灌流30 min内,细胞内荧光强度较HBS缓冲液灌注组明显降低。 2、在离体制备的大鼠SN脑片上,用100μmol/LKATP通道开放剂diazoxide灌流后,DA能神经元的细胞膜出现超极化,自发放电频率降低。 3、应用钙黄绿素,观察KATP通道开放剂diazoxide对SK-N-SH细胞摄铁功能的影响。结果显示给予Fe2+灌注后细胞内荧光较单独HBS缓冲液灌注组出现明显的衰减,用100μmol/L的Fe2+和100μmol/L开放剂diazoxide混合液灌流,细胞内荧光较单独Fe2+灌注组出现明显减弱。 4、干涉掉DMT1后,观察KATP通道开放剂diazoxide对SK-N-SH细胞摄铁功能的影响,结果显示给予Fe2+灌注后干涉组细胞内荧光强度与空载体组细胞相比明显增强。用100μmol/L的Fe2+和100μmol/L开放剂diazoxide混合液灌流,干涉组细胞内荧光强度与空载体组相比明显增强。 5、构建KATP通道的Kir6.2和SUR1的高表达载体,稳定转染HEK293细胞,用携带DMT1+IRE的重组腺病毒感染细胞,应用全细胞膜片钳记录KATP通道开放剂diazoxide对DMT1介导的铁电流的影响。结果显示单纯给予Fe2+灌流,可以快速诱导出内向整流的铁电流,此电流失活较快;同时给予diazoxide和Fe2+灌流,也可以快速诱导出铁电流,并且电流的衰减减缓。 6、应用电感耦合等离子体发射光谱仪检测SK-N-SH细胞铁含量的变化,结果显示100μmol/L diazoxide预处理组Fe2+孵育后细胞内铁含量与单纯100μmol/L的Fe2+孵育组相比明显增加。应用流式细胞仪观察细胞内△Ψm以及活性氧物质(ROS)的变化,结果显示100μmol/L KATP通道开放剂diazoxide预处理组Fe2+孵育后,细胞内△Ψm与单独100μmol/L的Fe2+孵育组相比明显降低,而ROS生成明显增高。 7、构建KATP通道的Kir6.2和SUR1的高表达载体,转染SK-N-SH细胞,在高表达Kir6.2和SUR1的细胞和空载体细胞上,分别给予100μmol/L开放剂diazoxide与100μmol/LFe2+共同孵育,高表达组细胞的摄铁功能以及细胞内的铁含量与空载体组相比明显升高;细胞△Ψm明显降低,ROS生成的量明显增多。 8、分别用100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L的MPP+处理高表达Kir6.2和SUR1的细胞和空载体细胞,300μmol/L的MPP+可以明显降低空载体细胞的存活率而100μmol/L、200μmol/L MPP+的对空载体细胞的存活率没有影响;对于高表达组细胞,100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L的MPP+均可以降低细胞的存活率。同时我们观察到,对于空载体组细胞,100μmol/LMPP+不影响空载体细胞△Ψm及ROS的生成;而100μmol/L的MPP+可以明显降低高表达组细胞的△Ψm,增加ROS的生成。 综上所述,KATP通道SUR1选择性开放剂diazoxide作用于细胞后,可以引起细胞膜超极化,细胞的放电频率降低。细胞膜的超极化可以增强DMT1的铁摄取功能,从而使细胞内的铁增多,由于铁的细胞毒性以及产生自由基的能力,加剧了铁介导的氧化应激损伤。高表达KATP通道(Kir6.2和SUR1)可以增加细胞的铁摄取及铁介导的氧化应激损伤;增强MPP+介导的细胞毒性作用。本研究将为KATP通道参与黑质多巴胺能神经元的铁聚集及选择性损伤提供新的新的理论和实验依据。


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