收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

反义c-myc基因转染抑制后发性白内障的实验研究

孙洁  
【摘要】:目的 后发性白内障(简称后发障)是白内障摘除术后影响视力的最主要并发症之一,虽经多年不懈努力研究,至今尚未解决。术后2~5年成人发生率高达50%,儿童更是高达100%,目前尚无有效的药物进行防治。因此,研究如何减少后发性白内障的发生,提高患者术后视力,具有重要的临床意义。 多年来,人们在不断改良人工晶状体的设计和手术技术的同时,还尝试了药物、激光、手术等多种治疗手段,但对儿童白内障和并发性白内障的效果均无法令人满意。基因治疗近年来在多种难治性疾病的防治方面取得了很大的发展,显示出其优越的先进性和较为令人满意的效果。目前,已有大量的体外实验显示,反义基因疗法可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡的发生。反义c-myc基因转染对人视网膜色素上皮细胞、乳腺癌细胞、淋巴瘤细胞、肝癌细胞等的增殖均有良好的抑制作用。基于反义c-myc基因治疗抑制上述细胞增殖研究的成功经验,我们认为通过转基因技术调控细胞周期,改变细胞增殖活性,很可能是一种极有前景的防治后发性白内障的途径。 本研究通过体外、体内实验,利用转基因技术在国内外第一次将反义c-myc基因转染晶状体上皮细胞,观察其对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响,从细胞周期的改变、mRNA和蛋白质水平的变化等方面探讨其抑制后发性白内障发生的作用。 反义c一myc基因转染抑制后发性白内障的实验研究 2004孙洁博}论文 材料和方法 一、体外实验 1.293细胞及永生化人晶状体上皮细胞(HLEC)的培养 一2.两种重组腺病毒(Ad一Lacz,Ad一AS一myc)的扩增、纯化与滴度测定 3.重组腺病毒转染效率的测定 将Ad一LaeZ按MOI(感染强度,Multiplieity ofxnfeetion)100,200感染HLEe, 48h后进行X一Gal染色。显微镜下观察,计算蓝染细胞占所有细胞的百分率,即为 转染效率。 4.Ad一AS一myc转染对HLEC影响的检测 (l)细胞形态学改变 将Ad一As一myc按Mol 100感染HLEc,于感染后每日观察并记录细胞的形态变 化,并与正常HLEC进行比较。 (2)细胞生长曲线的变化 以5 x 103个细胞/孔接种HLEC至6孔板,培养过夜。按MOI 100将Ad一AS一myc 转染细胞。定期(转染后24、48、72、96h)消化收集细胞,计算细胞密度。将实 验结果与对照组进行比较。 (3) MTT比色法分析细胞增殖的变化 以103个细胞/孔接种HLEc至%孔板,培养过夜。按MOI 100将Ad一AS一myc 转染细胞。定期(转染后24、48、72、%h)加入MTT溶液,4h后吸弃孔内上清液, 加入DMSO,振荡,在酶联免疫测定仪上检测其在492nm处的吸光值。将实验结果 与对照组进行比较。 (4)流式细胞仪的检测 l)细胞凋亡的测定(Annexin一v Kit法):按MOI 1 00将Ad一AS一mye感染HLEC, 48、96h后采用Annexin一v Kit法检测,MultiGraph软件分析结果。将实验结果与对 照组进行比较。 2)细胞周期分析:按MOI 100将Ad一AS一myc感染HLEC,48、96h后常规 DNA倍体检测,Multicycte软件分析结果。将实验结果与对照组进行比较。 (5)Rl’- PCR检测c一mye mRNA的表达 反义c一myc基因转染抑制后发性白内障的实验研究 2004孙洁博!论文 按Mol 1 00将Ad一As一myc感染HLEc,48、96h后分别提取细胞总RNA,紫外 分光光度计定量后进行逆转录,逆转录产物进行PCR,tubulin为内对照。琼脂糖凝 胶电泳分离PCR产物,紫外灯下观察。图像分析系统分析底片的灰度。将实验结果 与对照组进行比较。 (6)免疫组织化学法分析c一myc蛋白质的表达 按MOI 1 00将Ad一AS一myc感染HLEc,48h后进行免疫组化检查。将实验结果 与对照组进行比较。 (7)Western Blotting分析e一mye蛋白质的表达 按MOI 1 00将Ad一As一mye感染HLEC,48、96h后提取细胞总蛋白质,用BCA Protein Assay Kit定量,蛋白质样品进行sDs一PAGE电泳,将电泳产物转至硝酸纤维 膜上,按ECL蛋白分析试剂盒方法杂交。图像分析系统分析底片的灰度。将实验结 果与对照组进行比较。 二、体内实验 1.实验动物 对38只新西兰白兔均行单眼超声乳化透明晶状体摘除术。选用Storz Premium 超声乳化仪,全部手术均获成功。 2.实验分组:随机分为四组。 A组:空白对照组10只 术毕前房注射平衡盐溶液 B组:Ad一LacZ组8只 术毕前房注射Ad一LacZ C组:Ad一AS一myc注射一次组10只 术毕前房注射Ad一AS一myc D组:Ad一As一myc注射二次组10只 术毕及术后Zd,前房注射Ad一 AS一myc 3.术后检测项目 (l)裂隙灯检查 术后第一周的每一天及14、21、28d,行裂隙灯检查,观察后囊混浊出现的时 反义c一myc幕因转染抑制后发性白内障的实验不J于究 2004孙洁博士论文 间、形态改变以及眼内其它部位的反应情况并记录。 (2)病毒转染效率的测定 术后Zd,取B组2眼,仔细分离晶状体囊袋,X一Gal染色,显微镜下观察晶状 体上皮细胞中有无蓝染的阳性细胞,计算转染效率。 (3)非靶向性转染的测定 术后Zd,取B组2眼,x一Gal染色,观察有无角膜


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王少坤;;健康饮食可以降低女性白内障风险[J];心血管病防治知识;2010年11期
2 李绍南;;β-阻断剂可使白内障风险增加[J];心血管病防治知识;2009年11期
3 张鲲;李晓陵;王炜;王宁;崔霞;;老年性白内障手术资料数据库的建立[J];军医进修学院学报;2011年08期
4 王艳玲;;老年白内障伴发青光眼急性期及术后护理体会[J];吉林医学;2011年25期
5 夏敏;张然;李桂蓉;;临床路径在白内障超声乳化患者中的应用[J];医学信息(上旬刊);2011年08期
6 黄慧;刘敏;杨丽彬;禹菊仙;李才锐;;296例白内障HIV抗体阳性率调查[J];大理学院学报;2011年06期
7 郝淑珍;;白内障手术73例护理体会[J];临床合理用药杂志;2011年14期
8 卓玛;;藏区638例白内障患者术前术后护理[J];青海医药杂志;2011年05期
9 黄文丽;蒋永祥;吕志刚;;兔晶状体超声乳化后囊膜混浊模型的建立与观察[J];中国眼耳鼻喉科杂志;2011年01期
10 刘翠云;;1100例白内障患者围手术期的感染控制[J];中华医院感染学杂志;2011年12期
11 张金娃;;白内障患者围手术期护理[J];求医问药(下半月);2011年01期
12 伍建斌;许昌泰;王伯良;;PubMed数据库1813/2010年中相关白内障的文献计量学分析[J];国际眼科杂志;2011年09期
13 李志强;;谷胱甘肽滴眼液治疗白内障的临床疗效分析[J];吉林医学;2011年27期
14 周丹;;高翔复明扶贫工程为黑龙江省第五批白内障患者带来光明[J];现代经济信息;2006年11期
15 肖敏;;白内障超声乳化术并发症临床分析[J];中国医药指南;2011年22期
16 李芳;;联合手术治疗白内障合并青光眼的临床疗效比较[J];中外医疗;2011年24期
17 徐萌;赵梅生;尹洪影;;老年白内障手术患者相关心理研究的现状与进展[J];中国老年学杂志;2011年16期
18 陈荣健;;膨胀期白内障继发急性闭角型青光眼行超声乳化术的临床观察[J];中国医药指南;2011年17期
19 黄珺;张淑君;黄彩霞;;白内障超声乳化联合人工晶体植入术临床护理[J];医学信息(中旬刊);2011年07期
20 赵忻;;高频彩色多普勒超声对老年性白内障术前检查的应用价值[J];中国社区医师(医学专业);2011年24期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张甲生;周淑贤;;白内障与元素医学食疗[A];中国微量元素科学研究会第十二届学术研讨会论文集(三)[C];2005年
2 许家骏;张南;高慧筠;;超声乳化人工晶体植入及前玻切手术治疗儿童先天性白内障[A];第三次全国中医、中西医结合眼科学术交流会论文汇编[C];2003年
3 边建军;夏林;;白内障小切口在防盲治盲中的应用[A];2006年浙江省眼科学术会议论文集[C];2006年
4 李海祥;闻华明;刘广川;;轴性近视白内障人工晶状体屈光度计算误差原因分析[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
5 董君艳;王力光;;犬白内障的临床分类及病理特性[A];第十三次全国养犬学术研讨会论文集[C];2009年
6 邓姣姣;;高龄白内障患者围手术期的护理[A];2006年浙江省眼科学术会议论文集[C];2006年
7 闻华明;刘广川;李海祥;;轴性近视白内障人工晶状体屈光度计算误差原因分析[A];2007年贵州省医学会眼科学分会第五届第三次学术年会论文汇编[C];2007年
8 罗建平;查学强;;霍山石斛多糖调节机体免疫与抗白内障功能及结构鉴定的研究[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编(1933-2008)[C];2008年
9 吴琰;;超声乳化治疗白内障[A];全国五官科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2002年
10 刘玉芳;刘小英;王霞明;杨舒文;;高龄白内障患者围手术期的护理[A];全国五官科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙洁;反义c-myc基因转染抑制后发性白内障的实验研究[D];青岛大学;2004年
2 徐雯;钙蛋白酶在过氧化氢诱发的白内障发生机制中的作用和氧化性白内障的预防[D];浙江大学;2002年
3 谷峰;遗传性白内障致病基因的定位及其突变分析[D];中国协和医科大学;2006年
4 赵晔;S-腺苷蛋氨酸对胃癌增殖和c-myc、uPA基因甲基化的影响[D];郑州大学;2010年
5 钟翠萍;c-Myc及CyclinA2基因诱导大鼠耳蜗前体细胞增殖的体外研究[D];第四军医大学;2010年
6 朱寒阳;补肺通络解毒法对小鼠Lewis肺癌P53和C-myc蛋白分子表达的影响[D];湖北中医药大学;2011年
7 李闻捷;晶体蛋白时相性改变及对老年性白内障形成的影响[D];第二军医大学;2005年
8 张先荣;一个遗传性白内障家系的基因分析及白内障相关Cx50-缝隙连接通道的调控机制研究[D];武汉大学;2005年
9 罗怡;晚期糖基化终末产物在糖尿病性白内障中的作用及其分子机制研究[D];复旦大学;2008年
10 于雷;癌基因c-Myc、Kras及Notch2与辐射诱发胸腺淋巴瘤的相关研究[D];吉林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙学华;年龄相关性白内障晶状体前囊膜中c-myc基因的表达[D];青岛大学;2005年
2 邓志华;苦参素对人肝癌细胞株Bel-7404细胞增殖和E2F1、c-myc表达的影响[D];广西医科大学;2011年
3 辛小川;75例儿童淋巴瘤临床病理分析及EB病毒感染、c-myc基因改变的相关性研究[D];中国医科大学;2010年
4 蔡贵阳;膀胱尿路上皮癌中C-myc, FBP1及FIR的表达及临床意义[D];中国医科大学;2010年
5 严晓梅;MiRNAlet7、Ras、HMGA2、C-myc在非小细胞肺癌中的表达及临床病理学意义[D];苏州大学;2010年
6 杜海爽;Notch1、c-myc及p21在乳腺癌中的表达及冬凌草甲素对乳腺癌Bcap-37细胞的作用研究[D];苏州大学;2010年
7 刘赫;FBP1和C-MYC在肾透明细胞癌中的表达及意义[D];中国医科大学;2010年
8 甘伟;MiR143和C-Myc在直肠腺癌中的表达及意义[D];中南大学;2010年
9 张巧琳;HepaCAM通过调节c-Myc抑制肾癌增殖[D];重庆医科大学;2011年
10 邢宝春;p53、c-myc基因蛋白及PCNA在食管癌及癌前病变中的表达及意义[D];山西医科大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 卫新华;老人如何防治白内障[N];重庆日报;2000年
2 学曾;治白内障方[N];民族医药报;2004年
3 ;白内障小知识[N];上海中医药报;2000年
4 副主任医师 吴国健;白内障早期有何征兆[N];卫生与生活报;2003年
5 黄玫 谢楚光;提防引发白内障[N];医药经济报;2002年
6 陈川;要防白内障多吃什么好[N];医药养生保健报;2005年
7 记者 李旭兵;今明两年近26万白内障患者有望复明[N];河南日报;2008年
8 陈玉 记者 刘永春;我市实施残疾人白内障复明工程[N];咸阳日报;2008年
9 记者 李建成;2010年底前:全市“白内障”消除障碍[N];周口日报;2008年
10 记者 杨光林 实习生 刘林鹏;刘保仓赴商水看望慰问白内障患者手术康复情况[N];周口日报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978