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钝顶螺旋藻多糖抗乙型肝炎病毒的实验研究

刘冰  
【摘要】:目的 研究钝顶螺旋藻多糖(polysacchrides of spirulina platensis,PSP)在乙型肝炎病毒基因转染细胞系HepG2 2.2.15中对细胞干扰素受体(IFN-αRmRNA)表达的调节作用;对HBeAg和HBsAg表达以及对HBV-DNA合成的抑制作用,为进一步开发其做为抗乙肝病毒药物提供理论及实验依据。 方法 HepG2 2.2.15细胞经胰酶消化后,以含10%胎牛血清的MEM培养液制成3×10~5个/ml细胞悬液,加入96孔培养板中,每孔200μl,48h后更换液体,用含2%胎牛血清的MEM维持液稀释PSP(其余成分与营养液相同)至终浓度3200μg/ml、1600μg/ml,800μg/ml,400μg/ml、200μg/ml,每孔200μl,每个浓度设6个复孔,并设不加药对照组,置5%CO_2孵箱中37℃连续培养72h,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT assay)、活细胞计数法观察PSP对HepG2 2.2.15细胞毒作用;将上述细胞接种于24孔细胞培养板,48h换液,每孔加入含400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml4个浓度PSP的MEM维持液1ml,每浓度设3个复孔,并设相应细胞对照组,分别在24h、48h、72h、144h取细胞培养液上清,通过ELISA法(加定量标准品)定量检测PSP对HepG2 2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响;实时FQ-PCR法定量检测PSP对HBV-DNA合成的影响;分别将PSP处理72h、144h的HepG2 2.2.15细胞涂片,原位杂交法检测PSP对该细胞IFN-αRmRNA表达的影响。 结果 ①PSP对2.2.15细胞毒性较低,半数有毒浓度(TC_(50))大于3200μg/ml,最大无毒浓度(TC0)为6004-280μg/ml。②24h,400μg/ml PSP对HBsAg平均抑制率为22.35+3.06%(P<0.05),其余浓度PSP无抑制作用;48h,400μg/mlPSP抑制率为29.19+5.09%(P<0.01),200μg/ml PSP抑制率为21.47±2.26%(P<0.05),其余浓度未见明显的抑制作用;72h,各浓度PSP抑制率分别为 34.67±4.66%(P<0.01)、26.86±3.00% (P<0.01)、21.70±3.05%(P<0.01)、15.74±1.61(P<0.05);144h,其抑制率分别为46.50±2.41%(P<0.01)、35.83±1.10%(P<0.01)、29.274±1.68%(P<0.01)、23.83±1.94%(P<0.01)。③24h,各浓度PSP对HBeAg未见明显的抑制作用;48h,400μg/ml PSP平均抑制率为43.23±1.05%(P<0.01)、200μg/ml平均抑制率为38.46±4.63(P<0.05);72h,平均抑制率分别为47.87±3.58%(P<0.01)、39.84±4.45%(P<0.01)、23.88±2.08%(P<0.01)、16.81±0.33%(P<0.05);144h,其抑制率分别为40.99±6.35%(p<0.01)、38.47±2.73%(P<0.01)、 中文摘要 23.52士0.90%(P0.05)、20.46士0.91%(P0.05)。④72h,各浓度PsP对HBV-DNA 的抑制率分别为33.94士0.36%(P0.01)、23.87士6.03%(P0.01)、 16.72士0.510,0(P0.05)、13.64士0.13%(P0.05);一44h,其抑制率分别为 36.79士4.14%(P0.01)、29.22士3.79%(P0.01)、22.38士6.87%(P0.01)、 !9.32士5.49%(P0.05)。⑤各浓度PSP作用72h,IFN一a凡nRNA表达百分率分 别为49.18土2.56、41.33士1.76、29.83士7.79、23.67士2,75,对照组为11.00士2.29; 作用144h,IFN一aRmRNA表达百分率分别为81.67士3.25、71.33士2.08、 57.83士3.51、38.67=f= 5.53、17.83士4.93,对照组为17.83士4.93。 结论无毒浓度PSP在HePGZ 2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞 HBsAg、HBeAg的分泌以及HBv-DNA的合成,抑制作用有明显的量效和 时效反应关系;PSP还能促进细胞IFN一aRn1RNA的表达。实验结果显示: PSP既可通过提高机体细胞免疫应答状态又可直接抑制HBV抗原分泌及病 毒DNA复制发挥其抗HBV组作用。本研究为进一步深入研究PSP作用机 制及开发其作为抗HBV药物提供理论及实验依据。


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