发育调控基因Pax2的克隆化及重组Pax2的真核表达

【摘要】：目的:本研究拟从人肾细胞癌组织中克隆全长配对盒基因(paired box,Pax2),构建hPax2高效真核表达载体,通过转染肾细胞癌(renal cell cancer,RCC)患者外周血单核细胞(PBMCs)并经诱导、培养获得的未成熟DCs,制备hPax2/DCS疫苗,探讨hPax2/DCS疫苗临床应用的可行性。 方法:提取肾细胞癌组织总RNA,并以Oligo(DT)引物逆转录合成cDNA;根据GeneBank中人Pax2 mRNA全长开放读框(M89470),设计扩增人Pax2完整开放读框序列的PCR引物,分别引入限制性内切酶酶切位点;PCR扩增目的基因hPax2;将回收纯化的PCR产物经限制性内切酶酶切后,T4连接酶定向克隆入原核表达载体pTrcHis2B,构建重组质粒pTrcHis2B-hPax2,切下目的基因片段,连接至真核表达载体pcDNA4/HisMax构建重组质粒pcDNA4/HisMaxp-hPax2,经酶切分析初步验证后,DNA测序,确认hPax2全长开放读框正确插入真核表达载体多克隆位点。 采集肾细胞癌患者血,分离PBMCs,以重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素-4和重组人肿瘤坏死因子-α诱导培养,得到未成熟DCs和成熟DCs,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪(FCM)分析细胞表型;以复合阳离子脂质体介导真核重组表达载体pcDNA4/HisMax-hPax2转染未成熟DCs,反转录PCR(RT-PCR)检测转染细胞hPax2基因的表达;应用SPSS 11.0统计软件包的Chi-Square test和One-way ANOVA进行统计学处理,P0.05作为差别有显著性标准。 结果:经PCR扩增获得1.2kb大小的目的基因片段,构建的重组质粒pTrcHis2B-hPax2经酶切及DNA测序鉴定,表明从人肾细胞癌组织中获得完整Pax2基因开放读框,序列无误,插入方向正确。构建的真核表达重组质粒pcDNA4/HisMaxp-hPax2经限制性内切酶分析,表明重组正确。 倒置相差显微镜下可见贴壁的单核细胞聚集成散布的细胞集落;培养至第7天部分细胞悬浮生长,可见典型树突状细胞(dendritic cellS,DC_s)形态;加入TNF-α培养至第10天,大部分细胞呈悬浮状态,细胞形态更典型;同时FCM分析显示,RCC患者外周血中贴壁的PBMCs经rhGM-CSF和rhIL-4诱导培养第7天,细胞表面标志为典型的未成熟DCs表型:CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR均呈低表达,CD3几乎无表达;PBMCs在rhGM-CSF+rhIL-4+TNF-α条件下,培养至第10天,细胞表面