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急性损伤对鼠视网膜谷氨酰胺合成酶的影响及地塞米松干预的实验研究

张军富  
【摘要】: 研究背景及目的 谷氨酸是整个中枢神经包括视网膜中主要的兴奋性神经递质,高浓度的谷氨酸可以对视网膜神经节细胞产生兴奋性毒性作用,因此视网膜中谷氨酸代谢的有效调控对于维持正常的视网膜功能非常重要。谷氨酸神经传输的终止灭活是靠表达在神经细胞和胶质细胞上的谷氨酸转运体将细胞胞外的谷氨酸转运到细胞内,但在谷氨酸-谷氨酰胺循环中,起限速酶作用的是谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)。正常情况下视网膜细胞外谷氨酸的摄取主要由Muller细胞完成。有研究发现GS在视网膜中只表达于MUller细胞。GS影响着MUller细胞转运谷氨酸的功能,只有GS把谷氨酸转化为谷氨酰胺,降低了细胞内谷氨酸的浓度后,谷氨酸转运体转运谷氨酸的功能才得以正常进行。所以,病理状态下GS表达量降低、活性下降必将造成细胞外液谷氨酸浓度的升高,引起视网膜神经节细胞的损伤。基于此,从降低谷氨酸浓度来保护视网膜神经节细胞的角度考虑,研究GS的基因表达和变化是探讨视神经保护的极其重要一环,也为揭示青光眼视网膜视神经损伤机制及探讨新的保护治疗方法提供依据。 在以前的研究中,李树宁博士通过大鼠Muller细胞的培养发现高压力状态下GSmRNA表达下降。闫桂刚博士通过静脉烧灼法建立慢性高眼压模型,发现高眼压状态下GSmRNA表达量和酶活性低于对照组(P<0.05)。证明了慢性高眼压状态下体内Muller细胞代谢谷氨酸的能力降低。目前有关急性高眼压造成视网膜急性损伤后GS表达变化的研究较少,本实验通过建立大鼠视网膜急性损伤的高眼压模型对GS基因表达及酶活性变化进行了研究,探讨了其变化规律及调控机制。体外实验表明糖皮质激素可调节GS的表达,实验中我们也观察了地塞米松干预后大鼠视网膜GS基因表达及酶活性的变化。 材料和方法 健康Wistar大鼠126只(青岛大学医学院附院动物实验中心提供),雌雄兼用,体重200-250g,实验前测量并记录眼压。其中6只大鼠于眼压升高结束后2周处死取其眼球,石蜡包埋切片,进行HE染色并观察视网膜厚度的改变。 余120只大鼠分成B、C两组,B组,60只,用于GSmRNA及酶活性的测定,C组,60只,用于GS蛋白表达量的测定。在实验中以RT-PCR半定量GSmRNA,以分光光度计测定GS酶活性,以Western blot法测定GS蛋白表达量。 B组中,60只大鼠随机分为对照组(B_1)、穿刺组(B_2)、加压组(B_3)、加压+地塞米松注射组(B_4)。B_1组5只大鼠处死后取左眼用于实验对照。B_2组5只大鼠,以左眼为穿刺眼,输液瓶液面高于角膜顶点15cm,于术后24h时间处死。B_3组25只,以左眼为实验眼。B_4组25只大鼠,以左眼为实验眼,加压结束即刻腹腔注射地塞米松0.5mg/kg。B_3组和B_4组大鼠在加压结束后4h、12h、24h、36h、72h时间点处死,各时间点5只大鼠。 C组再分组同B组,分别为C_1、C_2、C_3、C_4(见附表1)。 高眼压模型采用前房灌注加压法:10%水合氯醛腹腔注射麻醉后将大鼠头部固定在操作台上,暴露左眼。将灌注液生理盐水瓶悬置于液平面至大鼠左眼角膜顶点垂直距离150cm(压力约110mmHg,1mmHg=0.133kPa)处。带侧孔的5号针针尖白内眦角膜缘内1.5mm处刺入,平行推进,由外眦角膜缘内穿出,调整针体侧孔位于瞳孔区。加压持续60min。 结果 1.第一章 加压结束后2周,大鼠角膜透明,瞳孔圆,晶体无混浊。标本经HE染色观察,实验组视网膜厚度较对照组变薄(P<0.05)。 2.第二章 ①穿刺组,GSmRNA表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 ②加压组GSmRNA表达量4h即开始升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),24h达高峰(P<0.01),36h时开始下降(P<0.01),72h恢复正常水平(P>0.05)。 ③加压+地塞米松,GSmRNA表达量4h开始升高,与对照组及加压组比较均有统计学意义(P<0.05);与加压组比较,12h(P<0.05),24h(P<0.01),36h(P<0.05);72h时与对照组及加压组比较均无统计学意义(P>0.05)。 3.第三章 ①穿刺组,GS蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05) ②加压组,GS蛋白表达量在术后12h开始升高,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),24h达高峰(P<0.05),36h仍高(P<0.05),72h恢复正常水平(P>0.05) ③加压+地塞米松注射组,GS蛋白表达量术后12h时升高,但与加压组比较差异无统计学意义(P>0.05),24h达高峰(P<0.05),36h仍高(P<0.05),72h差异无统计学意义(P>0.05)。 4.第四章 ①穿刺组,GS酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 ②加压组,GS酶活性在术后4h明显下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),12h时仍低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),24h时(P>0.05),36h时升达高峰(P<0.05),72h恢复正常水平(P>0.05)。 ③加压+地塞米松注射组,GS酶活性术后4h降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),与加压组比较无统计学意义(P>0.05),12h水平仍较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05),但较加压组高(P<0.05),24h至36h时维持高峰状态,24h水平与加压组比较差异有统计学意义(P<0.05),36h水平与加压组比较差异无统计学意义(P>0.05),72h差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 1.本实验以前房灌注加压法获得了成本低、可重复性好的急性高眼压动物模型,保证了实验顺利进行。 2.大鼠视网膜急性损伤后GSmRNA水平有一个明显的升高过程,最高表达量升至正常的1.73倍。地塞米松可促使其表达,最高表达量达正常的2.10倍。 3.大鼠视网膜急性损伤后GS蛋白表达量也呈现升高,最高表达量升至正常的1.12倍。地塞米松可增强GS蛋白的表达,最高表达量是正常的1.23倍。 4.大鼠视网膜急性损伤后GS酶活性明显下降,后渐恢复并升高,下降最高幅达32.4%,升高最大幅为19.9%。地塞米松使之降幅减小(26.1%),增幅提前。


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