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琥珀酸在大鼠海马CA1区对GABA能和Glu能神经递质系统的调制作用

丛红群  
【摘要】: 琥珀酸(succinate),因来自天然经典中药琥珀而得名,是存在于自然界的一种有机酸,具有抗癫痫、镇静、镇痛等多种生物活性。琥珀酸也是三羧酸循环的中间代谢物,其化学结构与脑内神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、神经调质牛磺酸相似,位于三羧酸循环及脑内特有的Glu-GABA-琥珀酸代谢旁路的枢纽地位,不仅参与能量代谢,也影响兴奋性Glu和抑制性GABA神经递质平衡。GABA、Glu、牛磺酸均是脑内活性物质,脑内琥珀酸含量变化直接影响脑能量代谢并与Glu和GABA的转化有关,本课题组已在点燃动物模型上证明了琥珀酸的中枢抑制活性,结果表明琥珀酸可能是一种天然的内源性神经调质(neuromodulator)。 点燃(kindling)模型为神经生理和药理学研究、突触后长期增强(LTP)和脑可塑性提供了一个较理想的动物研究模型,点燃模型可用于癫痫、精神疾病、成瘾及记忆机制研究,GABA和Glu是参与点燃的主要神经递质。本实验室在前期研究中观察到琥珀酸可抑制脑杏仁核电点燃、化学性PTZ点燃及海马快速点燃,证明了琥珀酸具有中枢抑制效应,但具体机制尚待阐明。前文报道琥珀酸可延长GABA-A受体拮抗剂苦味毒诱发小鼠惊厥的潜伏期,说明琥珀酸中枢抑制作用可能与增强GABA-A受体功能有关,但琥珀酸对GABA能和Glu能神经递质系统的调质作用研究未见报道。本文拟在细胞水平证明琥珀酸的神经调质作用。 本实验采用红外可视脑片膜片钳技术观察了琥珀酸在大鼠海马CA1区对GABA-A受体介导的抑制性突触后电流(IPSCs)的作用,以及L、N、P等钙通道亚型的特异性阻断剂和激动剂、细胞内钙库IP_3受体的激动剂Thapsigargin、细胞内钙库Ryanodine受体的激动剂Ryanodine、蛋白激酶A(PKA)的特异性阻断剂KT5720、Ca~(2+)和钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaM-KⅡ)的特异性阻断剂KN62、GABA-A受体苯二氮卓(BZ)结合位点的特异性阻断剂Flumazcnil对此调节作用的影响;观察琥珀酸对离子型Glu受体介导的兴奋性突触后电流(EPSCs)的作用;采用传统全细胞膜片钳技术,观察了琥珀酸对Glu及其离子型受体激动剂-AMPA、KA和NMDA诱发电流的作用;采用传统全细胞膜片钳技术和制霉菌素(Nystatin)穿孔膜片钳技术观察了琥珀酸对高电压激活(HVA)和低电压激活(LVA)钙电流的作用。初步探讨了琥珀酸对GABA能和Glu能神经递质系统的调制作用及作用机制,为琥珀酸调质功能研究提供有价值的理论和实验依据。实验结果表明: 1.琥珀酸在大鼠海马CA1区能提高GABA-A受体介导的微小抑制性突触后电流(mIPSCs)和自发性抑制性突触后电流(sIPSCs)的频率,不影响其电流幅度。1μM琥珀酸作用后,mIPSCs的频率为1.97±0.20 Hz,sIPSCs的频率为4.76±0.76 Hz,两者分别与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。 2.为探讨琥珀酸引起mIPSCs频率增加的作用机制,本文观察了N型钙通道的特异性阻断剂ω-Cg-GVIA;N型和P/Q钙通道的特异性阻断剂ω-Cm-MVIIC;L型钙通道的特异性激动剂BAY K-8644和阻断剂Nicardipine对此作用的影响。在ACSF中加入ω-Cg-GVIA后不影响mIPSCs频率,而ω-Cm-MVIIC降低mIPSCs频率,BAY K-8644升高mIPSCs频率,而Nicardipine能完全阻断BAY K-8644引起的mIPSCs频率升高。以上所有激动剂和阻断剂都不影响mIPSCs幅度。当ω-Cg-GVIA、ω-Cm-MVIIC和Nicardipine同时应用时,对琥珀酸引起mIPSCs频率增加的现象没有影响。应用细胞内钙库IP_3受体的激动剂Thapsigargin升高mIPSCs的频率,而琥珀酸引起mIPSCs频率增加的现象不再出现。细胞内钙库Ryanodine受体的激动剂Ryanodine、PKA的特异性阻断剂KT5720、Ca~(2+)/CaM-KⅡ的特异性阻断剂KN62对琥珀酸引起mIPSCs频率增加的现象均没有影响。 3.琥珀酸能延长mIPSCs和sIPSCs的半衰减时间。1μM琥珀酸作用后,mIPSCs的半衰减时间为8.73±0.50 ms,sIPSCs的半衰减时间为8.14±0.55 ms,两者分别与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。 4.为探讨琥珀酸引起mIPSCs半衰减时间延长的作用机制,我们又观察了BZ结合位点特异性阻断剂Flumazcnil和Ca~(2+)/CaM-KⅡ的特异性阻断剂KN62对此作用的影响。以Zolpidem作为阳性对照,Zolpidem明显延长了mIPSCs的半衰减时间,应用Flumazcnil可完全阻断Zolpidem引起的mIPSCs半衰减时间的延长,但Flumazcnil不能抑制琥珀酸引起的mIPSCs半衰减时间的延长,Ca~(2+)/CaM-KⅡ的特异性阻断剂KN62却能阻断此现象。 5.琥珀酸对微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)和自发性兴奋性突触后电流(sEPSCs)的频率和半衰减时间都无影响,而能降低其电流幅度。 6.Glu及其离子型受体激动剂-AMPA、KA和NMDA在大鼠海马CA1区均能引出内向电流。琥珀酸可抑制Glu、AMPA和KA诱发的电流,而对MDDA诱发的电流无抑制作用。 7.不同浓度的琥珀酸对HVA钙电流的抑制呈浓度依赖性。1μM琥珀酸作用后,HVA钙电流从581.04±6.13 pA减小到562.74±5.89 pA,两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。琥珀酸对LVA钙通道电流未见任何影响。 上述实验结果表明:琥珀酸在大鼠海马CA1区能增加突触前GABA释放;增加氯通道的开放时间或频率,对海马CA1区神经元产生超极化作用。此作用可能是琥珀酸抗点燃的主要机制之一。电压依赖性钙通道,主要是高电压激活的钙通道(P/Q和L型钙通道)影响突触前GABA释放,但与琥珀酸增强突触前GABA的自发性释放无关。Ryanodine敏感的细胞内钙库、细胞内的PKA和Ca~(2+)/CaM-KⅡ信号通路不影响琥珀酸增强突触前GABA的自发性释放。IP_3敏感的细胞内钙库Ca~(2+)释放是琥珀酸增强突触前GABA释放的主要因素。与Zolpidem不同,琥珀酸对GABA-A受体的调节作用不是通过作用于其BZ结合位点实现的;Ca~(2+)/CaM-KⅡ通路的激活是琥珀酸对GABA-A受体功能调节作用的途径之一。琥珀酸对突触前Glu释放没有影响,而能降低EPSCs的电流幅度,通过影响突触后膜受体功能而抑制兴奋性突触活动。琥珀酸在大鼠海马CA1区对Glu引起的兴奋性突触后电流有抑制作用,能通过加速离子型Glu受体的AMPA和KA受体亚型的脱敏,降低兴奋性反应而发挥其药理学作用。琥珀酸还可以通过某种作用机制抑制VGCC的开放,通过减小高电压激活的钙电流减小细胞兴奋时Ca~(2+)进入细胞的数量,调节胞内Ca~(2+)浓度及胞内级联反应。 综上所述,琥珀酸在大鼠海马CA1区对GABA能和Glu能神经递质系统均有调制作用,其可能通过以Ca~(2+)为核心的调节机制作用于GABA系统,从而提供了琥珀酸作为脑内神经调质的证据。本实验对琥珀酸调节GABA能和Glu能神经递质系统的研究,为琥珀酸作为脑内新型神经调质的作用机制研究提供了理论和实验依据,为把琥珀酸开发成一种安全、天然的新型抗神经精神药物提供了新的思路。


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