慢病毒载体介导的TNF-α基因在脐血间充质干细胞中的表达的实验研究

【摘要】： [目的]：构建带有人TNF-a基因的慢病毒载体,并观察该基因在人脐血间质干细胞中的表达。 [方法]：通过逆转录聚合酶链反应从PCD DNA-TNF-a质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelperl.0和包膜质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-a),空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(UCBMSCs),分别用重组慢病毒,空载慢病毒,PBS感染后,采用RT-PCR以及Elisa检测TNF-a表达情况。 [结果]：(1)所获TNF-a基因测序证明与Gene Bank中序列一致：(2)重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-a经鉴定正确；(3)三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L。(4)重组慢病毒感染人脐血间质干细胞后行RT-PCR检测三组细胞电泳结果显示均有TNF-a mRNA表达,其中实验组光密度值(2.71±1.57),与空载对照组(4.63±1.32),空白组(6.03±0.88)比较差异有统计学意义(F=11.677,P0.01)；ELISA检测三组细胞TNF-a浓度结果显示实验组(1.32±0.23ug/ml)与空载对照组(0.70±0.25ug/ml),空白组(0.76±0.11ng/ml)比较差异有统计学意义(F=21.321,P0.01)。 [结论]：(1)构建带有TNF-a基因的慢病毒载体,包装生产高滴度重组慢病毒；(2)重组慢病毒成功感染脐血间质干细胞并实现TNF-a在脐血间质干细胞中的表达；(3)转基因TNF-a脐血间充质干细胞的构建为治疗胃癌的应用奠定理论基础。