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嗜麦芽寡养单胞菌D2株碱性磷酸酶基因的克隆与表达

杨丽  
【摘要】: 目的本实验室自沙蚕消化道分离的嗜麦芽寡养单胞菌D2株可大量胞外分泌某单一蛋白。以纯化获得该蛋白为线索,根据该蛋白部分氨基酸序列,通过生物信息学分析和分子生物学技术,获得该蛋白的完整编码基因,并在原核系统中诱导表达,为进一步研究D2株该蛋白的分泌表达机制奠定基础。方法将D2菌株该蛋白纯品用ESI-MS/MS进行部分氨基酸序列片段测序,将测序得到的6个氨基酸序列通过PUBMED数据库中的BLAST工具进行对比,发现该蛋白的氨基酸片段均与嗜麦芽寡养单胞菌K279a和R551-3等的碱性磷酸酶(AKP)序列有较高的同源性,根据上述2菌株基因序列保守区设计PCR引物,扩增D2株完整包含AKP编码基因的序列片段,将产物连接至T载体中测序。然后设计带有酶切位点的引物,PCR扩增AKP的完整开放读码框(ORF),产物纯化并双酶切后与表达载体pET-32a连接,转化大肠杆菌BL-21,并用IPTG诱导表达;表达产物用本实验室制备的D2 AKP多克隆兔抗进行Western Blot鉴定,并检测其48h发酵液上清冻干浓缩后的碱性磷酸酶活性。结果以嗜麦芽寡养单胞菌D2株的基因组为模板进行PCR扩增后,将产物测序,得到了一个1438bp的基因序列,其中包含了1233bp的AKP完整开放读码框(申请获得GenBank号:GQ413951)。将该1233bp开放读码框翻译成蛋白质后与K279a和R551-3的碱性磷酸酶蛋白序列比对,同源性分别为68.5%和73.6%;并与ESI-MS/MS测序后的6个氨基酸序列比对,同源性分别为100%、100%、63.2%、77.8%、88.9%和42.1%。将该ORF在大肠杆菌中诱导表达后,得到一个分子量约为66KD的重组蛋白,经Western Blot鉴定证实即为D2分泌的AKP;同时经软件分析发现我们得到的D2株的AKP基因的ORF前20个氨基酸为信号肽序列,推测此序列在在该蛋白的胞外表达中发挥了重要的作用。酶活测定证明该蛋白48h的发酵上清具有碱性磷酸酶活性,酶活性约为18.79金氏单位。结论成功获得了嗜麦芽寡养单胞菌D2株的AKP完整编码基因,并进行了原核表达,经初步的酶活测定证实该蛋白具有碱性磷酸酶活性,为研究D2株的分泌表达机制以及此酶的进一步开发利用奠定了基础。


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