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可诱导表达hBMP-2基因的慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定

栾冲  
【摘要】: 目的构建可诱导表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因的慢病毒载体,转染人胚胎肾上皮细胞系293FT细胞获得相应的病毒颗粒,感染并获得在强力霉素诱导条件下高效表达hBMP-2的人脐带间充质干细胞,为下一步可诱导表达hBMP-2的人脐带间充质干细胞移植治疗骨坏死奠定坚实的实验基础。 方法以pcDNA-hBMP-2为模板,采用聚合酶链反应法扩增前后端带有attB重组位点的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)全长序列。利用Gateway载体构建技术,将扩增产物通过BP反应克隆至pDown载体中,测序正确后,采用LR重组酶将pDown-hBMP-2, pUp-TRE和pLV/Des2-Neo进行重组反应,构建慢病毒载体表达质粒pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2.将pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2与包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5)混合,利用脂质体共同转染293FT细胞,包装携带hBMP-2基因的慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞,在强力霉素(doxcycline)诱导下,用ELISA检测目的细胞hBMP-2的表达情况。 结果通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证可诱导hBMP-2真核表达慢病毒载体构建成功;pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2与包装质粒共转染包装细胞293FT细胞,成功获得携带hBMP-2基因的慢病毒颗粒,继之感染人脐带间充质干细胞,在强力霉素诱导条件下,使其高效表达hBMP-2。 结论成功构建出可诱导表达hBMP-2基因的慢病毒载体,获得浓缩lentiviral-hBMP-2病毒液,在此基础上最终获得可以在强力霉素诱导条件下高效表达hBMP-2的人脐带间充质干细胞,为下一步可诱导表达hBMP-2的人脐带间充质干细胞移植治疗骨坏死奠定坚实的实验基础。


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