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CD59-siRNA对裸鼠移植人卵巢癌细胞CD59沉默效应的研究

冯翠萍  
【摘要】: 目的:前期体外实验证明了针对CD59的pSUPER-siCD59重组载体能能有效抑制卵巢癌细胞系A2780细胞上CD59的表达并使其抗补体活性下降,增加了肿瘤细胞对补体攻击的敏感性,有利于机体对肿瘤细胞的清除。本研究采用本课题组设计的pSUPER-siCD59重组载体,通过稳定转染A2780细胞,从体内实验进一步探索该重组载体对CD59的沉默效应及抑瘤作用。 方法:采用脂质体转染法将干扰质粒pSUPER-siCD59(T组)和空质粒pSUPER(V组)分别转染A2780细胞,G418选择性培养基中筛选具有抗性的单细胞来源的细胞克隆,扩大培养;将前两组A2780细胞和未转染(C组)的A2780细胞分别接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型,连续观察30天,记录肿瘤出现时间,游标卡尺测量肿瘤长轴和短轴,绘制肿瘤生长曲线,并通过移植瘤组织切片CD59 mRNA原位杂交、RT-PCR、CD59蛋白免疫组化和Western Blot研究其抑瘤效应及对CD59的沉默效应。 结果:pSUPER-siCD59重组载体和空质粒pSUPER转染A2780细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆;裸鼠移植瘤瘤生长曲线显示,与对照组相比,CD59干扰质粒转染组肿瘤生长明显受抑制(P0.05)且生长缓慢,V组与C组的瘤体积和重量的差异无统计学意义(P0.05);原位杂交可见CD59mRNA的阳性表达主要位于细胞质,呈蓝紫色颗粒,T组CD59mRNA阳性表达明显低于V组和C组(P0.05),V组和C组CD59mRNA阳性表达差异无统计学意义(P0.05);RT-PCR结果中CD59电泳条带的灰度值经同一标本的GAPDH条带的灰度值校正后统计分析,T组CD59mRNA阳性表达明显降低(P0.05);免疫组化可见CD59阳性表达主要主要位于细胞膜,也可见于细胞浆,T组中CD59表达明显低于其他组(P0.05);Western Blot结果与免疫组化结果一致。 结论:裸鼠体内实验表明,特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达,增加了卵巢癌细胞对补体攻击的敏感性,从而抑制卵巢癌在体内的生长,进一步说明了CD59在肿瘤免疫逃逸中的作用。


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