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原位合成高密度基因芯片表面处理研究

贺训军  
【摘要】: 基因芯片技术是90年代中期发展起来的重大科技之一,它是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术,具有重大的基础研究价值和明显的产业化前景。基因芯片是将核酸或核酸片段按照一定的顺序排列在固相支持物上构成高密度探针阵列,利用核酸杂交原理检测未知分子。基因芯片制备技术的关键步骤是玻片表面预处理,即对玻片表面进行羟基化、氨基化和醛基化处理,使表面生长的活性基团能有效固定寡核苷酸探针,以满足原位合成高密度基因芯片对玻片的要求。 实验选用表面平整的德国玻片,将清洗好的玻片分别进行羟基化、氨基化、醛基化,采用荧光法和原子力显微镜法分别检测玻片表面预处理质量,研究两种检测方法之间的内在联系,从而确定表征玻片表面寡核苷酸探针固定率的方法。 研究表明,氨基化试剂浓度对玻片荧光背景有影响,氨基化试剂处理时间、醛基化处理时间、紫外交联能量和洗涤温度和时间等工艺因素影响寡核苷酸探针的固定率。荧光检测试验结果证明,当2%氨基处理20min,5%戊二醛处理24min,紫外交联能量为150mJ,洗涤温度和时间分别为20℃和5min时,玻片的荧光强度最强,表明连接寡核苷酸的数量多,即固定率高。原子力显微镜对表面形貌研究表明,玻片预处理工艺不同时,其表面活性基团的形状、分布均匀性和尺寸大小也随之变化。两种检测方法表明,当活性基团呈柱状、分布均匀且尺寸比较大( 200nm)时,有利于寡核苷酸探针的连接,且连接探针数量多,玻片表面荧光强度强,固定率高;当活性基团呈锥状、分布及尺寸不均匀(150nm(300nm)时,连接的寡核苷酸探针数量少,玻片表面荧光强度弱,固定率低。 本文还研究了原位合成高密度基因芯片的光刻工艺,确定适合制作原位合成高密度基因芯片标记化的最佳工艺参数。


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