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腺病毒介导的PTEN基因防治大鼠肝纤维化的体内外实验研究

安君艳  
【摘要】:肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是多种慢性肝病向肝硬化进展的必经阶段,是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应,持续发展则导致不可逆转的肝硬化,甚至肝癌。因此,肝纤维化是临床干预的主要目标,但迄今尚无理想的治疗手段。 国内外共识,合成与分泌细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞——肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)在肝纤维化发生发展中发挥着核心作用。在此过程中,HSCs经历活化、增殖、大量合成ECM等阶段,并分泌各种细胞因子,以自分泌与旁分泌的形式作用于自身及周围细胞,从而促进以Ⅰ型胶原为主的ECM成分大量生成、沉积。HSCs增殖又是活化的重要表现之一,其数量增多也是引起ECM增多的最主要原因,因此,HSCs活化、增殖在肝纤维化发生发展过程中发挥了至关重要的作用。同时,活化的HSCs凋亡受抑,HSCs细胞数量只增不减,最终导致肝纤维化形成。全面了解肝纤维化的发生机制,能够为肝纤维化的综合治疗提供坚实的理论基础。其中,探索调控HSCs活化、增殖与凋亡的信号转导机制,对于寻求新的治疗方案具有重要意义。 第10号染色体缺失性磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今发现的第一个具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,可负性调控肿瘤细胞的细胞周期、抑制其增殖并诱导其凋亡,其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,陆续发现PTEN也参与多种纤维化疾病的发生发展。 我们在前期研究中发现,在胆总管结扎大鼠肝纤维化形成过程中,HSCs大量活化、增殖,而纤维化肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达逐渐下调,PTEN的动态表达与在体HSCs活化、增殖呈显著负相关,而与在体活化HSCs凋亡指数呈显著正相关,提示纤维化肝组织中PTEN的表达下调可能通过引起HSCs活化增殖加快及凋亡阻滞参与肝纤维化的病理过程。进一步在体外实验中,我们成功将以腺病毒为载体的野生型PTEN基因、其突变体G129E基因转染入体外培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6,发现过表达的野生型PTEN及G129E显著抑制体外活化HSCs的增殖、诱导其凋亡,负性调控HSCs细胞周期进程。但迄今为止,PTEN基因对原代HSCs及人HSCs细胞系增殖、凋亡、胶原代谢的影响以及阻断PTEN表达在此过程中可能发挥的作用尚不清楚,PTEN能否作为基因治疗的靶点而在肝纤维化的防治中发挥一席之地尚未可知。 因此,本实验在前期实验的基础上,构建了靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒,并分离了大鼠原代HSCs,观察增强与阻断PTEN表达对大鼠原代HSCs及人HSCs细胞系LX2增殖、凋亡、细胞周期调控以及胶原代谢的影响及其信号转导机制,从正反两方面证实PTEN基因对HSCs生物学行为的调控作用。在证实上述腺病毒在体外实验中对HSCs具有显著作用效果的基础上,我们进一步在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中,采用尾静脉注射法,将重组腺病毒导入大鼠体内,观察PTEN基因是否在体内具有潜在的抗肝纤维化作用,旨在为深入揭示肝纤维化的病理生理机制,寻求有效预防和治疗肝纤维的新策略提供理论依据和实验基础。实验内容主要包括以下四部分: 第一部分增强与阻断PTEN表达对肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用 目的:探讨过表达的野生型PTEN、其突变体G129E(丧失了脂质磷酸酶活性仅保留蛋白磷酸酶活性)、靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒PTEN shRNA对大鼠原代HSCs及人肝星状细胞系HSCs LX2增殖、凋亡与细胞周期的影响。 方法:采用原位循环灌流和密度梯度离心技术分离大鼠原代HSCs,荧光显微镜观察刚分离的原代HSCs,应用单克隆抗体α-SMA行免疫细胞化学染色鉴定活化的原代HSCs;利用AD293T细胞扩增实验所需的腺病毒(Ad-GFP、Ad-PTEN、Ad-G129E、PTEN shRNA),并测定滴度;将上述重组腺病毒瞬时转染体外培养的大鼠原代HSCs及人LX2,Western blot及real-time Q-PCR技术检测HSCs中PTEN表达变化;MTT及BrdU法检测HSCs增殖;流式细胞术分析细胞周期变化;Western Blot技术检测CyclinD1、CDK4及P27kip1的表达。实验分组如下:①Control组,仅以含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞,在转染步骤加入无血清无抗生素DMEM代替病毒液;②Ad-GFP组,转染表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的空病毒Ad-GFP;③Ad-PTEN组,转染携带野生型PTEN基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-PTEN;④Ad-G129E组,转染携带PTEN的突变体G129E基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-G129E;⑤PTEN shRNA组,转染携带靶向PTEN的短发卡状干扰RNA的重组腺病毒。 结果:①采用肝脏原位灌注法,以Nycodenz为介质一步法密度梯度离心成功分离大鼠原代HSCs。细胞得率为1.2×107至2.0×107/只,细胞存活率和纯度均大于90%。在倒置显微镜下观察刚分离的HSCs呈圆形,胞浆中含有较多脂滴,在波长328 nm的荧光显微镜下观察,刚分离的原代HSCs呈自发蓝色荧光。培养至10天,大鼠HSCs呈活化状态,脂滴消失,变成梭形肌成纤维样细胞。②原代HSCs性质鉴定。刚分离的HSCs免疫细胞化学染色α-SMA表达阴性;原代培养10天后α-SMA阳性染色率达100%。③通过反复感染AD293T细胞的方法使病毒扩增获得了实验所需的病毒液(Ad-PTEN、Ad-G129E、Ad-GFP的滴度分别为1.6×109、1.8×109、1.2×109、1.5×109 pfu/ml)。④腺病毒感染HSCs后72 h,应用real time Q-PCR检测两种细胞中PTEN mRNA表达,并采用相对定量2-△△Ct法比较PTEN mRNA在各组HSCs中的表达。原代HSCs组中,以Control组为对照组(其PTEN mRNA表达量为1),则Ad-GFP组、Ad-PTEN组、Ad-G129E组与PTEN shRNA相对Control组的PTEN mRNA表达倍数分别为0.994倍、1.698倍、1.624倍、0.357倍。进一步应用Western blot分析各组原代HSCs的PTEN蛋白表达,Ad-PTEN组(1.91±0.09)、Ad-G129E组(1.74±0.08)均显著高于Control组(1.21±0.05)及Ad-GFP组(1.15±0.04,P0.01,PTEN shRNA组(0.56±0.04)显著低于Control组及Ad-GFP组;而Control组与Ad-GFP组之间,以及Ad-PTEN组和Ad-G129E组之间均无显著性差异(P0.05)。证明上述腺病毒成功转染入大鼠原代HSCs,在人LX2中的检测结果与上述相似;⑤MTT检测结果显示,在一定时间范围内,野生型PTEN基因及G129E基因可以抑制原代HSCs及人LX2活化,其中在转染后72 h,Ad-PTEN基因使原代HSCs以及LX2细胞活力分别由对照组的100.00%降低至74.71%、50.43%,G129E基因使原代HSCs以及LX2细胞活力分别由对照组的100.00%降低至83.74%、61.95%;PTENshRNA组细胞活力则分别增至118.26%、142.15%;⑥BrdU法检测结果显示,野生型PTEN基因及G129E基因可以抑制原代HSCs DNA合成,在转染后72 h,同Ad-GFP组相比,Ad-PTEN组与Ad-G129E组DNA合成显著降低,分别降至63.32%、74.75%,PTEN shRNA则显著促进原代HSC DNA合成,增殖率为35.36%;在人HSC-LX2细胞中,Ad-PTEN组与Ad-G129E组细胞DNA合成分别降至42.38%、56.65%,而PTEN shRNA则显著促进细胞DNA合成,增殖率为57.13%;⑦Annexin-V/PE联合标记流式细胞术检测结果显示,重组腺病毒转染大鼠原代HSCs 72 h后,Ad-PTEN组HSCs凋亡率(34.85%±2.11%)、Ad-G129E组凋亡率(25.18%±1.34%)均显著高于Control组(3.12%±0.15%)及Ad-GFP组(4.21%±0.35%),P0.01;PTEN shRNA组(1.24%±0.08%)显著低于Control组及Ad-GFP组;在人LX2中,Ad-PTEN组与Ad-G129E组细胞凋亡率分别为41.76%±1.98%、37.18%±2.13% ,均显著高于Control组(5.68%±1.15%)及Ad-GFP组(7.21%±1.25%),P0.01;PTEN shRNA组(2.25%±1.18%)显著低于Control组及Ad-GFP组;⑧Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察发现,无论是大鼠原代HSCs还是人LX2细胞,野生型PTEN基因与Ad-G129E感染HSCs后72 h,均可见凋亡细胞,表现为核染色体浓集呈亮蓝色的碎片状,在细胞边缘聚集分布,细胞边缘不完整;而GFP组细胞及PTEN shRNA组细胞则很少看到上述现象,表现为核染色体呈椭圆形,内有颜色较深的蓝色颗粒,细胞边缘完整清晰;每张细胞片随机选取5个高倍视野,分别计数正常细胞数与凋亡细胞数,每个标本至少计数300个细胞以上,镜下计数细胞凋亡率,结果表明在原代HSCs中,Ad-PTEN组HSCs凋亡率(18.25%±1.23%)、Ad-G129E组凋亡率(15.18%±1.15%)均显著高于Control组(1.12%±0.15%)及Ad-GFP组(1.78%±0.09%) , P0.01 ; PTEN shRNA组中仅偶见到凋亡细胞(0.33%±0.01%),P0.01;⑨TUNEL检测结果表明,在腺病毒感染原代HSCs后72 h,Ad-PTEN组HSC凋亡率增至25.82%±1.53%,Ad-G129E组增至19.23%±0.97%,均显著高于Control组(1.22%±0.15%)及Ad-GFP组(1.43%±0.13%),P0.01;而Ad-PTEN组HSC凋亡率亦明显高于Ad-G129E组(P0.01);Ad-GFP组与Control组比较无显著差异(P0.05);⑩Caspase-3活性检测结果表明,过表达野生型PTEN基因与G129E基因可显著增加Caspase-3的活性,在原代HSCs中分别增加至2.16倍和1.73倍,而PTEN shRNA则抑制Caspase-3活性的活性,抑制率为62.13%;在人LX2中,Ad-PTEN与Ad-G129E分别使HSCs的Caspase-3活性增加至2.53倍和1.96倍,PTEN shRNA对人HSCs中Caspase-3活性的抑制率为71.23%;○11Western blot结果显示Ad-PTEN与Ad-G129E显著促进了原代HSCs与人LX2细胞中Bax的表达,抑制了Bcl-2的表达, Bax/Bcl-2比值也相应增加;○12野生型PTEN基因及G129E基因使大鼠原代HSCs和LX2细胞G0/G1期和G2/M期细胞比例上升,S期细胞比例下降;PTEN shRNA作用则与上述相反;○13野生型PTEN基因及G129E基因抑制大鼠原代HSCs和LX2中CyclinD1和CDK4的蛋白表达,促进了P27kip1的表达,PTEN shRNA作用则与上述相反。 结论:成功分离大鼠原代HSCs;野生型PTEN基因、G129E基因及PTEN shRNA重组腺病毒可成功转染大鼠原代HSCs以及人LX2;野生型PTEN基因、G129E基因过表达可明显抑制HSCs增殖,诱导HSCs凋亡,增加Caspase-3活性,并引起HSCs的凋亡调控基因Bax表达增加,Bcl-2表达下降,而且野生型PTEN的作用明显强于G129E;PTEN过表达可阻滞HSCs细胞周期时相于G0/G1期,这可能与其抑制CyclinD1、CDK4表达,而上调P27kip1表达有关,而PTEN shRNA转染结果则与野生型PTEN基因、G129E基因相反。 第二部分增强与阻断PTEN表达对肝星状细胞胶原代谢的影响 目的:探讨过表达的野生型PTEN、其突变体G129E(丧失了脂质磷酸酶活性仅保留蛋白磷酸酶活性)、靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒对大鼠原代HSCs及人肝星状细胞系胶原代谢的影响 方法:野生型PTEN、其突变体G129E、PTEN shRNA干预大鼠原代HSCs与人HSC LX2细胞72 h后,采用Western blot技术检测HSCs的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2及GAPDH蛋白表达。 结果:①Western blot技术检测大鼠原代HSCs中Ⅰ型胶原的蛋白表达,结果显示:Ad-PTEN组(0.32±0.05)、Ad-G129E组(0.47±0.07)均显著低于Control组(0.85±0.05)及Ad-GFP组(0.82±0.09),P0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P0.05),PTEN shRNA组(1.28±0.13)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P0.05)。对各组原代HSCsⅢ型胶原蛋白表达的检测结果显示,Ad-PTEN组(0.18±0.02)、Ad-G129E组(0.27±0.03)均较Control组(0.41±0.02)及Ad-GFP组(0.38±0.03)显著降低,P0.01,同时Ad-PTEN组明显低于Ad-G129E组(P0.05),PTEN shRNA组(0.72±0.07)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P0.01,Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P0.05)。对人LX2细胞的检测结果与上述相似;②Western blot技术检测大鼠原代HSCs中MMP-13的蛋白表达,结果显示:Ad-PTEN组(0.88±0.06)、Ad-G129E组(0.71±0.12)均显著高于Control组(0.51±0.03)及Ad-GFP组(0.47±0.02),P0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P0.05),PTEN shRNA组(0.36±0.03)较Control组与Ad-GFP组显著降低,P0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P0.05);对TIMP-1的检测结果显示:Ad-PTEN组(0.17±0.02)、Ad-G129E组(0.26±0.03)均显著低于Control组(0.38±0.06)及Ad-GFP组(0.42±0.03),P0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P0.05),PTEN shRNA组(0.73±0.12)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P0.05)。对人LX2细胞的检测结果与上述相似。③Western blot技术检测大鼠原代HSCs中MMP-2的蛋白表达,结果显示:Ad-PTEN组(0.85±0.07)、Ad-G129E组(0.71±0.02)均显著高于Control组(0.35±0.03)及Ad-GFP组(0.38±0.07),P0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P0.05),PTEN shRNA组(0.16±0.03)较Control组与Ad-GFP组显著降低,P0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P0.05);对TIMP-2的检测结果显示:Ad-PTEN组(0.34±0.04)、Ad-G129E组(0.48±0.08)均显著低于Control组(0.88±0.08)及Ad-GFP组(0.84±0.06),P0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P0.05),PTEN shRNA组(1.13±0.11)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P0.05)。对人LX2细胞的检测结果与上述相似。 结论:外源性野生型PTEN基因及G129E基因在大鼠原代HSCs及人LX2中的过表达可显著抑制HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,这可能与其上调MMP-13及MMP-2的表达,抑制TIMP-1及TIMP-2的表达有关;PTEN shRNA作用效果与上述相反。 第三部分PTEN调控肝星状细胞生物学行为的信号转导机制 目的:探讨PTEN调控大鼠原代肝星状细胞与人LX2细胞增殖、凋亡及细胞周期的信号转导机制。 方法:分离培养大鼠原代HSCs,体外培养活化人LX2细胞,以腺病毒为载体将野生型PTEN基因、其突变体G129E基因及PTEN shRNA重组腺病毒瞬时转染体外培养的上述两种细胞;Western blot技术检测HSCs的磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K (phosphoinositol-3-kinase, PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt)、p-Akt (Thr308)、黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、p-FAK (Tyr397)、细胞外信号调节激1(extracellular signal-regulated kinase1, ERK1)、p-ERK1蛋白表达。实验分组同第二部分。 结果:①Western blot检测证实外源性野生型PTEN基因及其突变体G129E基因在大鼠原代HSCs大量表达,而PTEN shRNA组PTEN表达显著降低(结果同第二部分);②腺病毒感染上述两种HSCs后72 h,real time Q-PCR检测原代HSCs组中PI3K mRNA表达,结果显示:以Control组为对照组(其PI3K mRNA表达量为1),则Ad-GFP组、Ad-PTEN组、Ad-G129E组与PTEN shRNA相对Control组的PI3K mRNA表达倍数分别为0.979倍、0.716倍、0.962倍、1.223倍,Ad-PTEN组较Control组及Ad-GFP组显著降低,P0.01,PTEN shRNA组显著升高,与各组相比均有显著性差异,P0.01,而Ad-G129E组与Control组及Ad-GFP组之间无显著性差异,P0.05;对人LX2的检测结果与上述趋势相一致;进一步采用Western blot检测PI3K蛋白结果显示:在原代HSCs中,Ad-PTEN组PI3K蛋白表达(0.49±0.02)显著低于Ad-G129E组(0.75±0.06)、Control组(0.82±0.07)及Ad-GFP组(0.79±0.03),P0.01,PTEN shRNA组(1.12±0.14)显著高于Ad-GFP组与Control组,P0.01,但Ad-G129E组、Control组及Ad-GFP组之间PI3K表达无显著差别(P0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致;③三种重组腺病毒对HSCs中Akt mRNA及蛋白表达均无明显影响(P0.05);而p-Akt(Thr308)表达则有显著改变。在原代HSCs中,Ad-PTEN组p-Akt(Thr308)蛋白表达(0.28±0.02)显著低于Ad-G129E组(0.48±0.03)、Control组(0.50±0.02)及Ad-GFP组(0.52±0.05),P0.01,PTENshRNA组(0.62±0.03)显著高于Ad-G129E组与Control组,P0.01,但Ad-G129E组、Control组及Ad-GFP组之间p-Akt(Thr308)表达无显著差别(P0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致。④腺病毒感染上述两种HSCs后72 h,real time Q-PCR技术及Western blot检测结果显示三种重组腺病毒对HSCs中总FAK mRNA及蛋白表达均无明显影响(P0.05);而p-FAK (Tyr397)表达则有显著改变。在原代HSCs中,Ad-PTEN组p-FAK (Tyr397)蛋白表达(0.42±0.05)及Ad-G129E组(0.49±0.07)均显著低于Control组(0.80±0.09)及Ad-GFP组(0.78±0.05),P0.01,PTEN shRNA组(0.92±0.07)显著高于Ad-GFP组与Control组,P0.01,但Ad-PTEN组与Ad-G129E组,以及Control组与Ad-GFP组之间p-FAK (Tyr397)表达无显著差异(P0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致。⑤腺病毒感染原代HSCs后72 h,real time Q-PCR技术及Western blot技术检测野生型PTEN及G129E对两种HSCs ERK1 mRNA及蛋白表达表达均无明显影响(P0.05);而p-ERK1蛋白表达则有显著改变。在原代HSCs中,Western blot显示Ad-PTEN组p-ERK1蛋白表达(0.25±0.02)、Ad-G129E组p-ERK1蛋白表达(0.28±0.07)均显著低于Control组(0.54±0.07)及Ad-GFP组(0.52±0.06),P0.01,PTEN shRNA组(0.70±0.05)显著高于Ad-G129E组与Control组,P0.01,但Ad-PTEN组与Ad-G129E组,以及Control组与Ad-GFP组之间p-ERK1表达无显著差异(P0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致。 结论:PTEN通过其磷酸酶活性抑制Akt、FAK、ERK1的磷酸化;其抑制HSCs细胞增殖、诱导HSCs凋亡、负性调控HSCs细胞周期、以及抑制HSCs细胞胶原合成的作用与PI3K/Akt、FAK/ERK1/2信号通路的活性抑制有关。 第四部分腺病毒介导的PTEN基因防治CCl4诱导的大鼠肝纤维化的实验研究 目的:研究PTEN在CCl4诱导的大鼠肝纤维化中的动态改变及应用重组PTEN腺病毒对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的防治作用 方法:采用成年健康雄性Wistar大鼠128只,随机分成预防组(Prevention groups,简写为Pre)(Pre 1 wk、Pre 3 wk、Pre 5 wk和Pre 7 wk组,每组15只)、治疗组(Treatment groups,简写为Tre)(Tre 1 wk、Tre 2wk、Tre 3 wk和Tre 4 wk组,每组15只)和正常对照组(8只),其中根据导入重组腺病毒的不同,预防组与治疗组每个时间点又分为如下5组(CCl4组;CCl4+Ad-GFP组;CCl4+Ad-PTEN组;CCl4+Ad-G129E组;CCl4+PTEN shRNA组),进行四肢轮流皮下注射40% CCl4橄榄油溶液(2 ml·kg-1,2次/周),造模时间共7周,预防组自第1周开始、治疗组自第4周开始在注射CCl4前分别自尾静脉注射Ad-GFP、Ad-PTEN、Ad-G129E、PTEN shRNA重组腺病毒,每周给药一次。自动生化仪检测大鼠肝功能改变;采用Haematoxylin and eosin staining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)方法观察肝脏病理学改变,免疫组织化学、免疫荧光方法、Western blot技术检测大鼠肝组织中PTEN及α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;采用免疫荧光双标记法、激光扫描共聚焦显微镜观察在体活化HSCs以及凋亡细胞中PTEN的表达改变;末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(TUNEL)及α-SMA免疫荧光双标记方法检测在体活化HSCs的凋亡;免疫组织化学、Western blot技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原在各组大鼠肝组织中的动态表达。 结果:①Ad-PTEN、G129E重组腺病毒注射后纤维化大鼠精神状态、进食水量及活动量较CCl4模型组好转,而PTEN shRNA腺病毒注射后纤维化大鼠精神萎靡、活动减少;②对大鼠肝功能的分析结果显示:各预防组及治疗组大鼠给予重组腺病毒野生型PTEN、其突变体G129E干预后,大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平较CCl4模型组显著降低,肝功能有所改善;而采用RNAi技术阻断PTEN表达则加重纤维化大鼠的肝脏损害;③HE染色显示,无论是预防组还是治疗组,给予Ad-PTEN和Ad-G129E干预后各组大鼠肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润均明显减轻,Ad-PTEN作用效果优于Ad-G129E,而PTEN shRNA组则较CCl4组及Ad-GFP组出现更为严重的肝细胞脂肪变性及炎症细胞浸润;Masson染色显示,给予Ad-PTEN与Ad-G129E干预后大鼠肝组织汇管区内仍有少量纤维组织生成,有短的纤维间隔伸入肝小叶,且随着造模时间延长,其肝纤维化程度也呈现逐渐加重的趋势,但与同一造模时间点的CCl4模型组与Ad-GFP对照组大鼠相比,其纤维化程度明显减轻;④PTEN免疫组织化学、免疫荧光染色显示,同CCl4组及Ad-GFP组相比,无论是预防组(Pre 1 wk~Pre 7 wk)还是治疗组(Tre 1 wk~Tre 4 wk)肝纤维化模型中,给予Ad-PTEN与Ad-G129E重组腺病毒干预后,肝组织中PTEN表达均显著增多,且肝组织中表达PTEN的细胞主要分布于汇管区与中央静脉周围;进一步采用Western blot技术检测PTEN在各组大鼠肝组织中的蛋白表达,结果显示给予Ad-PTEN与Ad-G129E重组腺病毒干预后肝组织中PTEN蛋白表达明显增多,而PTEN shRNA干预后大鼠肝组织中PTEN蛋白明显降低,表明以上三种重组腺病毒成功导入了纤维化大鼠体内;⑤α-SMA免疫组织化学、免疫荧光染色显示,给予Ad-PTEN与Ad-G129E干预后各造模时间点大鼠肝组织中α-SMA表达水平较Ad-GFP组与CCl4组显著降低,且Ad-PTEN对α-SMA的抑制作用强于Ad-G129E,进一步采用Western blot技术检测α-SMA蛋白在各组大鼠肝组织中的表达亦支持上述结论;进一步采用免疫荧光双重染色,激光扫描共聚焦显微镜观察活化HSCs中PTEN的表达变化,发现给予Ad-PTEN及Ad-G129E腺病毒干预后,同Ad-GFP组及CCl4组相比,活化HSCs中PTEN表达显著增加,且Ad-PTEN组中更为显著,P0.05;给予PTEN shRNA腺病毒干预后,大鼠肝组织中活化HSCs中PTEN表达显著降低,P0.01,说明PTEN高表达可抑制纤维化大鼠肝组织中HSCs的活化;⑥共聚焦激光扫描显微镜下观察TUNEL及α-SMA免疫荧光双重染色结果显示,给予Ad-PTEN与Ad-G129E重组腺病毒干预后,预防组自第3周始、治疗组从干预后第1周开始,活化HSCs数量显著增多,其中Ad-PTEN组作用效果优于Ad-G129E,而给予PTEN shRNA干预后大鼠肝组织中活化HSCs数量显著降低,说明PTEN的高表达能诱导活化HSCs的凋亡;⑦免疫组织化学与Western blot技术检测各组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,结果显示给予Ad-PTEN与Ad-G129E干预后各造模时间点大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平较Ad-GFP组与CCl4组显著降低,且Ad-PTEN对Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的抑制作用强于Ad-G129E,而给予PTEN shRNA干预后大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著增加,说明PTEN的高表达能够抑制HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成;⑧Pearson’s相关性分析表明,大鼠纤维化肝组织中PTEN表达与α-SMA表达呈显著负相关,与PTEN阳性的活化HSCs比例呈显著正相关,与活化HSCs凋亡指数呈显著正相关。 结论:采用CCl4皮下注射法可建立稳定可靠的肝纤维化大鼠模型,PTEN可能参与大鼠肝纤维化的发生发展;尾静脉导入野生型PTEN基因、Ad-G129E基因及PTEN shRNA基因可有效的感染肝纤维化模型大鼠,并可在肝纤维化大鼠中正确表达;野生型PTEN基因、G129E基因高表达可改善纤维化大鼠的肝功能、抑制大鼠肝组织中HSCs活化并促进其凋亡并抑制纤维化大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,从而减轻大鼠肝纤维化的进展,PTEN可能是防治肝纤维化的一个有效靶点。


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1 胡亚娥,吴扬,严志强;PTEN在心肌肥厚中的作用初探[J];中国应用生理学杂志;2003年03期
2 陈国庭;PTEN基因的研究进展[J];国外医学.遗传学分册;2001年02期
3 徐敏;PTEN/MMAC_1/TEP_1抑癌基因与子宫内膜癌的相关性[J];实用肿瘤杂志;2002年06期
4 陈明,陈洪雷,陈福春,朱润庆,刘铭球;转移性肺癌中TPEN蛋白的表达及其临床意义[J];数理医药学杂志;2002年06期
5 许逸卿,王春友,陶京,俞建雄;PTEN蛋白在胰腺癌中的表达及其意义[J];中华实验外科杂志;2003年07期
6 马玉芳,刘铭球,易建华,姚俊霞,熊奎,刘涛,朱红波;肿瘤抑癌基因PTEN在宫颈鳞癌中的表达及其与分化程度的关系[J];郧阳医学院学报;2003年01期
7 黄学勤,李清泉,李儒佑;小细胞肺癌中PTEN的表达及其与凋亡的关系[J];医师进修杂志;2004年09期
8 刘志香,路涛,黄长征,李家文,涂亚庭;皮肤肿瘤中PTEN基因突变的研究[J];中华皮肤科杂志;2004年12期
9 戴淑真,徐冰,姚勤,李超;子宫内膜癌、宫颈癌组织中PTEN基因突变的检测及意义[J];山东医药;2003年24期
10 刘斌,吴军正,雷德林,刘彦普;PTEN基因对粘液表皮样癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用[J];中国口腔颌面外科杂志;2003年01期
11 周传香;抑癌基因PTEN与头颈肿瘤研究进展[J];国外医学.口腔医学分册;2003年03期
12 项友群,徐美荣,方庆安,施公胜;c-erbB-2、PTEN在乳腺癌中的表达及其意义[J];南通医学院学报;2004年01期
13 李秋芳,杨新建,赵建军,杨瑞玲;星形细胞瘤中PTEN蛋白表达的意义及其与微血管密度的相关性研究[J];河南实用神经疾病杂志;2004年01期
14 马佳佳,陈必良,马向东,王德堂;抑癌基因PTEN在子宫内膜异位症发生发展中的作用[J];第四军医大学学报;2004年20期
15 马佳佳,陈必良;抑癌基因PTEN与子宫内膜异位症恶变的相关性[J];国外医学.妇产科学分册;2004年05期
16 江从庆,樊利芳,刘志苏,艾中立,钱群,何跃明,郑科炎,秦前波;PTEN和缺氧诱导因子-1α在大肠腺瘤一腺癌序列中的表达及意义[J];大肠肛门病外科杂志;2004年04期
17 徐锡金,霍霞,杨海伟,许险峰,朴仲贤,沈忠英;PTEN在人食管上皮永生化细胞株和食管癌细胞株中的表达[J];激光生物学报;2005年02期
18 张育军,魏丽惠,李小平,王建六;抑癌蛋白PTEN在雌激素和胰岛素样生长因子1诱导子宫内膜癌细胞ERK活化中的作用[J];癌症;2002年07期
19 张育军,魏丽惠,孙铁铮;子宫内膜癌组织中抑癌基因PTEN突变和表达的探讨[J];中国肿瘤临床;2003年02期
20 邢丽华;抑癌基因PTEN/MMAC1/TEP1与肺癌[J];国外医学.呼吸系统分册;2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 姚丹;何雪;江克文;赵正言;;大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马P13K/Akt信号通路及PTEN的分布与表达[A];2011年浙江省医学会儿科学分会学术年会暨儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2011年
2 程井军;吴其恺;彭锐;孙国杰;;电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织氧化及抗氧化状态的影响[A];中华中医药学会第十三届内科肝胆病学术会议论文汇编[C];2008年
3 杨珺超;宋康;鲁建锋;陈君峰;夏永良;;补肺汤对肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1作用的实验研究[A];2009年中华中医药学会内科分会全国中医内科临床科学研究专题研讨会论文汇编[C];2009年
4 廖慧慧;李芳;何燕萍;;罗氏内异方对子宫内膜异位症模型大鼠内膜整合素a vβ 3表达的影响[A];第九次全国中医妇科学术大会论文集[C];2009年
5 王进荣;王平;孟宪丽;杨永茂;张艳;;单向肠灌流法研究芦荟大黄素的大鼠在体肠吸收[A];第十一届全国中药药理学术大会论文摘要[C];2010年
6 史大卓;;接种Walker256肉瘤对急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影响[A];2010中国医师协会中西医结合医师大会摘要集[C];2010年
7 方杰;胡昔权;郑海清;潘三强;李莉莉;;运动训练对脑梗死大鼠室管膜下区神经新生的影响[A];中国康复医学会第十三届全国脑血管病康复学术会议会议指南[C];2010年
8 孙琳;郭春妮;赵永波;;BM6在Aβ致大鼠海马神经元损害中保护作用的研究[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
9 徐存拴;李三强;周爽;;麻醉对大鼠应激反应的影响[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学、免疫细胞生物学和发育生物学专业委员会学术研讨会论文摘要汇编[C];2002年
10 朱萱萱;王广基;刘建平;王淑云;徐轩;;口腔膜治疗实验性大鼠口腔膜溃疡的研究[A];中国制药工业药理学会20周年学术会议论文集[C];2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 安君艳;腺病毒介导的PTEN基因防治大鼠肝纤维化的体内外实验研究[D];河北医科大学;2011年
2 杨建新;腹部术后疲劳综合征模型及抗术后疲劳方作用的研究[D];湖北中医学院;2004年
3 杨丹榕;大鼠IgEFcCH2-3受体阻断与IgEFcCH2-3-FasL诱导肥大细胞凋亡的研究[D];第二军医大学;2004年
4 李玉茹;神经营养素及其受体在老年性大鼠耳蜗及下丘中表达规律的研究[D];吉林大学;2005年
5 陈党红;舒筋颗粒对卒中后肌张力增高的影响及可能作用机制探讨[D];广州中医药大学;2005年
6 卢奕;人羊膜细胞在创伤性脑损伤中应用的实验研究[D];苏州大学;2005年
7 潘静薇;NOGO-B在动脉粥样硬化病变中差异表达的研究[D];第二军医大学;2006年
8 王连友;大鼠液压冲击颅脑损伤模型的立体定向控制研究[D];天津医科大学;2006年
9 陈来照;神经肽Y及其受体在垂体腺瘤中的表达及意义[D];天津医科大学;2006年
10 朱志宏;不同性别大鼠创伤失血性休克后多形核白细胞反应的差异及胃复安干预的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 向芳;围产期大鼠血脂组成与乳腺炎症相关基因的表达变化研究[D];四川农业大学;2011年
2 吴芳庚;环境温度变化致大鼠小肠黏膜免疫屏障损伤的研究[D];南昌大学;2011年
3 崔国振;人脑胶质瘤中PTEN和COX-2的表达及临床意义[D];吉林大学;2010年
4 董华承;PTEN和nm23-H1在大肠癌中的表达及其临床意义[D];大连医科大学;2010年
5 方冬冬;口腔鳞癌组织中PTEN、COX-2表达和MVD测定及意义[D];安徽医科大学;2011年
6 杨科峰;基于BCI的大鼠运动行为控制的研究[D];郑州大学;2011年
7 戚红;宫颈癌中PTEN、P16和P15蛋白的表达及临床意义[D];青岛大学;2002年
8 张娇;PTEN在兔晶状体上皮细胞增殖中的表达及意义[D];中国医科大学;2003年
9 沈慧;原发性肝癌中PTEN蛋白表达及其与HBV感染的关系[D];山西医科大学;2004年
10 杨宁;非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、MVD的表达及临床意义[D];河北医科大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;关木通对大鼠致癌性的实验研究[N];中国医药报;2003年
2 刘霞;诱导多功能干细胞让小鼠长出大鼠胰腺[N];科技日报;2011年
3 ;丹参能加快放创复合伤大鼠创面愈合[N];中国中医药报;2005年
4 郑健刚;杜元灏;石学敏;针刺能增加脑缺血大鼠脑血流量[N];中国医药报;2005年
5 ;新抗病毒抗生素17997在大鼠体内药代动力学和组织分布研究[N];中国医药报;2003年
6 ;刺五加皂甙对大鼠血管性痴呆有防治作用[N];中国中医药报;2005年
7 ;中药复方能逆转腹主动脉缩窄大鼠心肌肥大[N];中国中医药报;2005年
8 孙忻;人类首次获得克隆大鼠[N];科技日报;2003年
9 阿胜;死亡阴影下孕育生机无限[N];医药经济报;2002年
10 程源;父母吸烟会导致婴儿厌食[N];大众卫生报;2004年
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