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肝素结合性表皮生长因子对肝星状细胞增殖和凋亡的影响及其机制的研究

张迪  
【摘要】:肝纤维化(liver fibrosis)是由于病毒、代谢、遗传和胆汁淤积等多种原因导致以细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积为特征的慢性肝损伤。肝纤维化最终导致肝硬化,部分进展为肝癌,因此肝纤维化是一个世界性的公共健康问题。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是产生ECM的主要细胞来源,是肝纤维化发生发展的中心环节。 肝星状细胞是肝脏的非实质细胞,主要以储存维生素A的静止形式存于正常肝脏中。然而,大量体内外研究发现多种致病因素作用致肝损伤,HSC失去维生素A变为表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的活化的HSC,并不断增殖,分泌丰富的I型胶原而促进肝纤维化的发展。多种细胞因子可以导致HSC增殖和胶原合成,如:血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和转化生长因子-β1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β1)。因此,探讨HSC活化增殖的的机制,可能为肝纤维化治疗提供新的思路。 肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF)是表皮生长因子受体家族的配体之一,可以结合并激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR/ErbB1)和ErbB4受体,进而激活丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导通路。最近的研究表明,HB-EGF能够刺激多种细胞增殖。CRM197是一种无毒性的白喉毒素突变体,是HB-EGF的特异性抑制剂,通过结合可溶性的HB-EGF阻断它与ErbB受体的结合和下游的信号反应。 细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase, ERK)是MAPK家族成员之一,PDGF和EGF等多种细胞因子通过各自受体激活Ras/Raf/ ERK信号转导通路,传导细胞增殖信号。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt信号通路可被多种生长因子和促有丝分裂原活化,对调控细胞周期、促进细胞分化和细胞生长起重要作用。Ras/Raf/ERK和PI3K/Akt信号通路在HSC的增殖、凋亡和胶原合成中发挥至关重要的作用。 本课题旨在研究HB-EGF对两种HSC细胞株(人HSC细胞株LX2和大鼠HSC细胞株T6)和原代HSC增殖和凋亡的影响及可能的分子机制。实验由以下三部分组成: 第一部分:HB-EGF在原代大鼠HSC中的表达 目的:研究HB-EGF在HSC活化过程中的作用。 方法:采用链酶、IV型胶原酶原位灌注肝组织和Nycodenz梯度离心技术分离大鼠原代HSC,采用荧光显微镜和α-SMA做免疫细胞化学染色的方法鉴定原代HSC。用免疫细胞化学和Western blot检测静止和激活的原代HSC中HB-EGF、phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表达;Western Blot检测CRM197干预静止状态的HSC后phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表达。 结果:①HSC的细胞的得率为1.5~2.0×107/只,细胞存活率和纯度均大于90%。刚分离的HSC呈圆形,胞浆内含有丰富的脂滴,在波长328 nm的荧光显微镜下观察,能激发出荧光。HSC培养10天,静止的细胞变为活化状态,富含维生素A的脂滴消失,变为梭形或星形。②大鼠原代HSC性质鉴定。未激活的HSC内不表达α-SMA;细胞培养14天后,全部激活的HSC胞浆内呈现α-SMA表达。③HB-EGF及ErbB受体在原代大鼠HSC激活后表达明显增加。刚分离的大鼠原代HSC内几乎不表达HB-EGF及其受体;而激活后的HSC内HB-EGF和ErbB受体表达明显增加。总的EGFR在原代HSC激活前后表达水平无明显差异。④CRM197对静止的大鼠HSC无明显作用。CRM197 (20μg/ml)干预刚分离的大鼠原代HSC,EGFR的磷酸化和ErbB4水平与对照组相比无明显差异。 结论:静止状态的原代大鼠HSC内几乎没有HB-EGF的表达,而HSC激活后HB-EGF表达明显增加,HB-EGF在原代HSC激活前后的改变可能预示着肝纤维化与HB-EGF这种细胞因子及其由它激活的下游信号通路密切相关。 第二部分:HB-EGF促进HSC增殖、抑制凋亡 目的:探讨HB-EGF和CRM197在HSC增殖和凋亡中的作用。 方法:HB-EGF不同浓度(10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)和时间点(12 h, 24 h, 48 h)干预活化的人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代大鼠HSC,四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测细胞增殖变化、溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)标记的掺入法测定细胞DNA合成。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同时干预经HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,MTT检测细胞增殖变化、BrdU掺入检测HSC DNA合成。CRM197预处理细胞24小时后更换培养基,给予HB-EGF 40 ng/ml干预LX2和T6和原代大鼠肝星状细胞24 h,透射电镜观察细胞形态学改变。末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL)检测HSC凋亡。CRM197预处理细胞24小时后,给予HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)干预HSC-T6和LX2细胞株12 h,24 h和48 h。膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(Propidium iodide, PI)联合标记流式细胞术检测HSC凋亡率和Caspase-3活性。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD9805925和25μmol/L LY294002同时干预经HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果:①HB-EGF能刺激人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC增殖。MTT检测显示不论CRM197抑制与否,HB-EGF均呈浓度和时间依赖性的刺激以上三种细胞增殖,其中HB-EGF高剂量组(40 ng/ml)干预24 h,使LX2、T6和原代HSC细胞增殖分别较对照组的100%增加至137.11±8.44% (P0.05)、138.74±6.21% (P0.05)和129.92±4.68% (P0.05);CRM197能抑制HB-EGF刺激后引起的HSCs增殖。②PDGF (20 ng/ml)刺激三种HSC增殖与HB-EGF (40 ng/ml)刺激增殖的作用相比无明显差异;CRM197发挥了与EGFR受体阻断剂类似的抑制作用。AG1478显著抑制了HB-EGF刺激的HSC增殖,与CRM197的抑制作用相比无明显差异;PD98059和LY294002均分别显著抑制了HB-EGF刺激后HSCs的增殖,与CRM197的抑制作用相比显著增加。③HB-EGF呈浓度和时间依赖性地刺激HSC DNA合成。BrdU-DNA掺入法测定结果显示HB-EGF高剂量组(40 ng/ml)干预24 h,使LX2、T6和原代HSC细胞DNA合成分别较对照组的100%增加至160.77±13.62% (P0.05)、154.33±5.55% (P0.05)和130.92±1.74% (P0.05);CRM197能够明显抑制HB-EGF刺激后引起的HSC DNA合成。④CRM197抑制人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC DNA合成,较HB-EGF刺激组相比明显降低(68.87±5.57% vs 160.90±13.57%, P0.05; 74.67±4.43% vs 154.33±5.55%, P0.05; 76.30±6.85% vs 130.92±1.74%, P0.05);AG1478、PD98059和LY294002均分别显著抑制了HB-EGF刺激后HSC的DNA合成。⑤透射电镜下观察HSC形态变化。浓度为20μg/ml的CRM197干预HSC 24 h后,细胞呈现凋亡特征:细胞体积变小,染色质凝集,新月体形成,核膜皱褶,粗面内质网扩张。⑥与对照组相比,20μg/ml CRM197分别提高LX2、T6和原代HSC细胞TUNEL染色阳性细胞率8.87倍(P0.05), 7.54倍(P0.05)和6.54倍(P0.05)。⑦HB-EGF抑制Caspase-3活性;20μg/ml CRM197分别将LX2、T6和原代HSC细胞Caspase-3的活性提高了1.56倍(P0.05), 1.65倍(P0.05)和1.70倍(P0.05)。 结论:HB-EGF能够刺激HSC增殖和DNA合成;CRM197能够诱导HSC凋亡,这种作用可能与Caspase-3的活性相关。 第三部分:HB-EGF对肝星状细胞增殖与凋亡影响的信号转导机制 目的:探讨HB-EGF对HSC细胞内ErbB受体以及下游的ERK和Akt信号转导通路的调节作用。 方法:HB-EGF或CRM197干预HSC 24 h后,免疫细胞化学和Western blot检测EGFR、ErbB4和p-EGFR的蛋白表达变化。经或不经CRM197 (20μg/ml)干预HSC 24 h后,以不同浓度的HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2细胞株和原代大鼠HSC 24 h,Western blot检测EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表达变化;RT-real time PCR测定EGFR和ErbB4 mRNA的表达。经或不经CRM197 (20μg/ml)干预HSC 24 h后,以HB-EGF (40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2细胞株和原代大鼠HSC 12 h,24 h和48 h,Western blot检测EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表达变化;RT-real time PCR测定EGFR和ErbB4 mRNA的表达。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同时干预经HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代HSC,横向比CRM197与三种抑制剂对以上信号分子的作用。 结果:①在HSC细胞核和细胞浆中均表达ErbB受体,HB-EGF能刺激HSC中p-EGFR和ErbB4表达增加;CRM197抑制p-EGFR和ErbB4的表达。②HB-EGF刺激HSC中ErbB4 mRNA水平表达增加;EGFR mRNA水平在原代HSC的各组间变化不明显。③HB-EGF上调两种HSC细胞株(LX2、T6)和原代HSC中ErbB受体和下游的ERK、Akt信号分子磷酸化水平,呈时间和剂量依赖性;CRM197抑制HB-EGF激活的LX2、T6和原代HSC内ErbB受体的表达,继而抑制了ERK和Akt信号通路的磷酸化。④CRM197发挥了与EGFR受体相应阻断剂类似的抑制作用。AG1478抑制了HB-EGF刺激后EGFR受体的磷酸化水平,继而抑制了下游的ERK和Akt信号分子的磷酸化水平,而CRM197则同时抑制了EGFR受体的磷酸化和ErbB4受体。⑤CRM197发挥了与ERK和Akt信号通路相应阻断剂类似的抑制作用。PD98059和LY294002均分别显著抑制了HB-EGF刺激后HSC内ERK和Akt信号分子的磷酸化水平,而CRM197则同时抑制了HB-EGF刺激后这两条信号通路的磷酸化,但是与PD98059和LY294002的抑制作用相比显著降低。 结论:HB-EGF可能通过EGFR和ErbB4受体,激活ERK和Akt两条细胞内信号转导通路,实现促进HSC增殖、抑制HSC凋亡的作用。


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