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上调Twist基因对SW480细胞株体外增殖及侵袭性影响的研究

惠捷  
【摘要】:目的:Twist基因是存在于人、果蝇、鼠等生物体内的碱性螺旋-环-螺旋(Basichelix loop helix ,bHLH)蛋白,作为一种转录因子,主要表达于胚胎胎盘、中胚层及成人的某些中胚层来源的未分化组织。Twist表达的蛋白在人有202个氨基酸、小鼠有206个氨基酸、蟾蜍有166个氨基酸序列构成,其中人类和小鼠的氨基酸序列具有96%的同源性,在不同的种属中其DNA结合区域有着100%的序列保守,所有Twist基因都能结合E-box的DNA序列:CANNTG。Twist基因在转录水平上调控多种基因的表达[1],最初是在胚胎发育过程中发现它的生物学功能,它可以通过促进上皮-间叶变(epithelial mesenchymal transition , EMT)来调节胚胎的发育。近期研究结果证实[2,3]Twist具有癌基因的特性,能够编码凋亡抑制蛋白,通过多个信号系统参与肿瘤的发生:抑制分化,通过降低P53上游的调控因子ARF的表达阻断P53信号通路,阻碍N-myc信号系统的传递,和抑制NF-κB通路等。它还参与了多种上皮来源的肿瘤细胞发生EMT并促进癌细胞侵袭转移,同时Twsit基因在肿瘤进展中可以诱导一系列间充质标志物的产生。研究表明, Twist基因高表达于多种实体瘤中(包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤以及骨肉瘤) ,并能够促进人乳腺癌和黑色素瘤细胞系的凋亡。之前我们已经有研究证实Twist基因在结肠癌细胞株HCT116中呈高表达,而在SW480细胞株中呈低表达,本实验通过将高表达Twist基因的质粒转染入体外培养的人结肠癌SW480细胞株中,观察Twist基因对细胞增殖及侵袭性的影响。 方法:本研究将高表达Twist基因的质粒和阴性对照的空载质粒瞬时转染入SW480细胞株中,通过G418筛选后,分别命名为转染组和对照组,经过RT-PCR和Western-blot方法的鉴定,获得稳定转染Twist基因的SW480细胞,再通过MTT法绘制转染组细胞和对照组细胞的生长曲线,然后通过细胞划痕实验和Transwell侵袭实验,观察Twist基因对细胞迁移能力和侵袭力的影响。 结果: 1 RT-PCR和Western-blot方法检测结果显示,稳定转染Twist基因的SW480细胞中TwistmRNA和Twist蛋白表达量均显著高于未转染组(P0.05)。 2通过MTT法绘制细胞生长曲线,结果显示,从第4天开始,转染Twist基因的SW480细胞生长速度明显高于对照组(P0.05)。 3通过细胞划痕实验显示,划痕24小时后转染组细胞迁移了(40.06±5.56),而对照组细胞迁移了(25.24±2.65),差异有统计学意义。48小时后,转染组细胞迁移了(75.77±8.06),而对照组迁移了(35.37±6.79),差异有统计学意义(P0.05)。 4体外侵袭实验结果显示,转染Twist基因的SW480细胞发生侵袭的个数为(154±12) ,未转染组细胞侵袭个数为(73±14),差异有统计学意义(P0.05)。 结论: 1通过本实验Twist基因成功转入SW480细胞株并且呈稳定表达。 2上调Twist基因表达后,SW480细胞体外增殖率明显上升,说明Twist基因能够增强SW480细胞的体外增殖能力。 3上调Twist基因表达后,SW480细胞体外迁移能力明显增强,说明Twist基因能够增强SW480细胞的迁移能力。 4上调Twist基因表达后,SW480细胞体外侵袭能力明显增强,说明Twist基因能够增强SW480细胞的体外侵袭能力。


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