缺钾对家兔心肌组织钾离子及Na~+-K~+-ATPase的影响

【摘要】：目的:应用低钾饲喂家兔制备缺钾动物模型,测定在此过程中家兔血浆钾离子浓度,心肌组织钾离子含量及Na~+-K~+-ATPase的活性和Na~+-K~+-ATPaseα_1、α_2亚基的蛋白表达,再进行补钾实验,探究家兔缺钾过程中血浆、心肌组织钾离子的变化规律,心肌组织Na~+-K~+-ATPase活性和α_1、α_2亚基蛋白表达对缺钾的反应,并探讨Na~+-K~+-ATPase对家兔缺钾及补钾过程中钾离子分布的影响。 方法: 1实验动物分组,模型制备及处理 清洁级健康家兔64只,雄性,兔龄12~14周,体重2.0~2.7kg(河北医科大学实验动物中心提供),随机分为8组,每组8只,其中6组按低钾饲喂的时间分为正常对照组(T_0组)、低钾3天组(T_1组)、低钾6天组(T_2组)、低钾9天组(T_3组)、低钾12天组(T_4组)、低钾15天组(T_5组),另外2组分别为补钾对照组(RC组)和补钾实验组(RE组)。家兔购入后正常饲喂一周开始低钾饲喂进行模型制备。T_0组和RC组仅给予正常饮食(每只家兔喂食正常饲料100g/d,自由饮普通水),T_1组给予低钾饮食(每只家兔喂食低钾饲料100g/d,自由饮蒸馏水)3天,T_2组给予低钾饮食6天,T_3组给予低钾饮食9天,T_4组给予低钾饮食12天,T_5组和RE组给予低钾饮食15天。T_0、T_1、T_2、T_3、T_4、T_5组家兔分别于设定饲喂时间结束后经耳中央动脉取血后开胸取心脏。RE组缺钾模型制备完成后静脉泵入氯化钾(KCl)行补钾实验,RC组作为其对照组同时给予补钾,两组家兔麻醉成功后,固定,于右股静脉穿刺置套管针建立液路,持续泵入KCl,于左耳中央动脉留置套管针,肝素封管,妥善固定以便取血,监测静脉泵入KCl过程中血浆钾离子浓度变化。待两组家兔血浆钾离子浓度均达到5.5mmol/L并稳定至少1h,停止泵钾,立即开胸取心脏以测定心肌钾离子含量。 2标本的采集处理及检测方法 T_0、T_1、T_2、T_3、T_4、T_5组家兔模型制备完成当天经耳中央动脉取血1ml,以测定血浆钾离子、钠离子及血红蛋白浓度,然后开胸取心脏。 T_0、T_1、T_2、T_3、T_4、T_5组家兔,分别于观察结束当天经耳缘静脉注射4%戊巴比妥1ml/kg,麻醉成功后迅速固定,剪去家兔胸毛,以75%的乙醇消毒胸部,用大剪刀剪开其胸部皮肤,逐层剪开肌肉、胸骨,掀开胸骨,充分暴露家兔心脏,分离心脏与周围组织,摘取心脏。RC组及RE组补钾实验结束后同法取心脏。 T_0、T_1、T_2、T_3、T_4、T_5组及RC组、RE组家兔取左心室前壁组织约35mg,用预冷等渗氯化锂冲洗,取滤纸反复吸干,准确称重,-20℃保存以测定心肌钾离子和钠离子含量。 T_0、T_3、T_5组家兔取左心室前壁组织2块,每块重约0.5g,迅速用预冷生理盐水冲洗,放入冻融管标记,置于液氮罐中冷冻保存。取材结束-70℃冰箱保存,分别留作测定心肌Na~+-K~+-ATPase活性和Na~+-K~+-ATPaseα_1、α_2亚基蛋白表达。T_1、T_2、T_4组家兔取左心室前壁组织1块,重约0.5g,用以测定心肌Na~+-K~+-ATPase活性,标本处理方法同T_0、T_3、T_5组。 血浆钾、钠离子浓度采用离子选择性电极测量法测定,血红蛋白浓度采用分光光度法测定。 心肌钾、钠离子含量采用火焰原子吸收光度法测定。 心肌Na~+-K~+-ATPase活性按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒检测总蛋白含量后用超微量ATP酶测试盒检测Na~+-K~+-ATPase活性。 心肌Na~+-K~+-ATPaseα_1和α_2亚基蛋白表达通过Western Blot法测定。 RC组心肌钾离子摄取量以RC组每只家兔心肌钾离子含量与T_0组心肌钾离子含量的均数之差表示;RE组心肌钾离子摄取量以RE组每只家兔心肌钾离子含量与T_5组心肌钾离子含量的均数之差表示。每只家兔心肌钾离子摄取量除以泵注KCl时间计算得到相应平均心肌钾离子摄取率。 所有数据采用spss17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x|ˉ±s )表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,如不满足条件,则采用秩和检验,P0.05表示差异有统计学意义,相关分析采用直线相关性及回归分析。 结果: 1低钾饲喂期间动物未见明显不适,对低钾饲料耐受良好。 2各组家兔体重及兔龄比较差异无统计学意义,P0.05。 3血浆钾、钠离子浓度和血红蛋白浓度的变化 T_1、T_2、T_3、T_4、T_5组血浆钾离子浓度较正常对照组(T_0组)逐渐降低,差异有统计学意义(P0.05);T_1、T_2、T_3、T_4、T_5组血浆钠离子浓度和血红蛋白浓度与正常对照组(T_0组)相比差异无统计学意义(P0.05)。 4心肌钾离子、钠离子含量的变化 T_1组心肌钾离子含量较正常对照组(T_0组)无明显降低(P0.05),T_2、T_3、T_4、T_5组心肌钾离子含量较正常对照组(T_0组)降低,差异有统计学意义(P0.05);T_1、T_2、T_3、T_4、T_5组心肌钠离子含量与正常对照组(T_0组)比较,差异无统计学意义(P0.05)。 5心肌Na~+-K~+-ATPase活性的变化 T_1、T_2组心肌Na~+-K~+-ATPase活性较正常对照组(T_0组)无明显升高(P0.05),T_3、T_4、T_5组心肌Na~+-K~+-ATPase活性较正常对照组(T_0组)升高,差异有统计学意义(P0.05)。 6心肌钾离子含量与心肌组织Na~+-K~+-ATPase活性的相关性 对心肌钾离子含量与心肌组织Na~+-K~+-ATPase活性进行相关性分析,二者表现为负相关,回归线性方程为Y=20.16-0.11X,决定系数R2=0.894,P0.05。 7心肌组织Na~+-K~+-ATPaseα_1和α_2亚基的蛋白表达 T_3、T_5组心肌Na~+-K~+-ATPaseα_1亚基蛋白表达水平较正常对照组(T_0组)升高,差异有统计学意义(P0.05);T_3、T_5组心肌Na~+-K~+-ATPaseα_2亚基蛋白表达水平较正常对照组(T_0组)降低,差异有统计学意义(P0.05)。 8补钾后心肌钾离子摄取量和平均心肌钾离子摄取率的比较 RE组心肌钾离子摄取量较RC组心肌钾离子摄取量升高,差异有统计学意义(P0.05);RE组平均心肌钾离子摄取率较RC组平均心肌钾离子摄取率升高,差异有统计学意义(P0.05);补钾结束时,RE组输注KCl的总剂量较RC组高,差异有统计学意义(P0.05)。 结论: 1本实验采用低钾饲喂可使家兔血浆钾离子降低,成功制备家兔缺钾模型。 2缺钾可造成心肌组织钾离子含量逐渐降低。 3缺钾可使心肌组织Na~+-K~+-ATPase活性升高,心肌组织Na~+-K~+-ATPase活性与心肌组织钾离子含量呈负相关。 4心肌Na~+-K~+-ATPaseα_1和α_2亚基对缺钾反应性不同,缺钾时α_1亚基蛋白表达水平升高,α_2亚基蛋白表达水平降低。 5补钾时缺钾家兔心肌对钾离子摄取能力增加,对钾升高耐受力增加。