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IGF-1在大鼠肝纤维化过程中的动态变化及扶正化瘀方对肝纤维化的影响

郑艳丽  
【摘要】:目的:肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种致病因素引起肝细胞损伤,继发肝脏炎症及肝组织自我修复的一个复杂的病理过程。该过程致使细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成和降解失衡,从而引起ECM在肝组织内过度沉积形成肝纤维化,甚则肝硬化。在肝纤维化形成的过程中,细胞因子起了关键性的作用。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是分泌各种细胞因子和产生ECM的主要细胞,HSC的激活、增殖是肝纤维化形成的关键环节。在HSC增殖、活化及合成ECM的肝纤维化过程中,多种细胞因子如转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)发挥着重要调控作用。在生理状态下,ECM的合成和降解处于一种动态平衡,从而维持肝脏的正常的组织结构及功能。然而,各种致病因素损伤肝脏,使其产生炎症反应,炎性细胞因子使HSC由静止状态变为活化状态,分泌各种细胞因子,促使HSC活化、增殖,同时产生ECM,使其在肝脏内沉积,形成纤维化甚则硬化。IGF-1是调节细胞生长、分化、增殖及机体代谢等的一种多肽类生长因子。体外研究发现IGF-1能够促进HSC活化、增殖和胶原合成,促进肝纤维化形成。然而,IGF-1在肝纤维化过程中的变化仍不十分明确。肝纤维化是各种慢性肝病进展为肝硬化的必经之路。肝硬化是慢性肝病终末阶段,可出现多种并发症,给患者造成极大痛苦。肝纤维化的治疗是控制肝硬化发生的关键。现已证实干扰素及核苷(酸)类似物,能通过抑制病毒复制,减轻炎症反应,抑制纤维化形成。然而,目前临床上抗肝纤维化的西药种类及疗效有限。中药以其多途径、多靶点的治疗调节作用在抗肝纤维化中发挥独特优势。扶正化瘀方主要由丹参、发酵虫草菌粉、松花粉、桃仁、绞股蓝等组成,中医学认为其具有活血祛瘀,益精养肝的作用,现代研究认为其能有效逆转肝纤维化。因此,我们建立了四氯化碳(CCL4)诱导的大鼠肝纤维化模型,以探讨IGF-1在实验性肝纤维化过程中的动态变化,同时用扶正化瘀方进行干预,观察扶正化瘀方对肝纤维化形成的影响及其对IGF-1的作用,为寻求有效的抗肝纤维化药物提供理论依据。 方法:本实验分两部分 第一部分:IGF-1在实验性大鼠肝纤维化自发逆转过程中的动态变化 选取雄性wistar大鼠66只,随机分为对照组,模型组。对照组腹腔注射生理盐水,模型组给予30%CCL4橄榄油腹腔注射,均为每周2次,共8周。于造模的第4周末开始,每隔2周,随机取模型组大鼠6只处死,对照组3只处死,观察至第14周末。 第二部分:扶正化瘀方对实验性肝纤维化及肝组织IGF-1的影响 选取雄性wistar大鼠57只,随机分成对照组、模型组和扶正化瘀方干预组。对照组腹腔注射生理盐水,每周2次,共8周;模型组给予30%CCL4橄榄油腹腔注射,每周2次,共8周;干预组造模方式同模型组,同时给予扶正化瘀方药液灌胃,每日1次,共8周。于第4、6、8周末随机取模型组及干预组大鼠6只处死,对照组3只处死。 将大鼠处死后,留取血和肝组织标本,检测血丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST);苏木素-伊红(HE)染色及Masson染色观察肝组织病理学改变;免疫组织化学染色法观察肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、IGF-1蛋白的表达;RT-PCR检测IGF-1 mRNA的表达;碱水解法检测肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的含量。 结果: 第一部分:IGF-1在实验性大鼠肝纤维化自发逆转过程中的动态变化 1血清学指标 模型组大鼠血清ALT、AST在第4、6、8周逐渐升高,第10周开始降低,在第14周时仍高于对照组。模型组大鼠各时间段ALT和AST均高于对照组。 2肝组织病理学变化 HE及Masson染色:对照组大鼠肝组织中肝小叶结构正常,肝细胞条索走行整齐,未见炎性细胞浸润,在血管壁、汇管区可见少量纤维结缔组织存在;模型组在第4周的肝组织,肝小叶结构被破坏,可见肝细胞变性、坏死,大量炎细胞浸润;第6周在第四周基础上可见肝组织出现肝细胞脂肪变性,汇管区逐渐可见大量纤维组织增生;第8周时肝细胞脂肪变性基本消失,可见大量纤维条索,假小叶形成明显。后期炎性细胞逐渐减少,纤维结缔组织减少。 3肝组织α-SMA和IGF-1蛋白表达 3.1肝组织α-SMA蛋白表达:免疫组织化学染色显示α-SMA在模型组各时间段与对照组相比均明显增加。对照组α-SMA仅在血管壁上有表达;随造模时间延长,模型组α-SMA表达逐渐增强,在血管壁、汇管区及纤维间隔均有阳性表达,第10周后逐渐减少。 3.2肝组织IGF-1蛋白表达:免疫组织化学染色显示对照组大鼠肝细胞浆表达少量IGF-1蛋白;模型组在第4、6、8周IGF-1表达逐渐增加,IGF-1在肝细胞浆及细胞膜均有表达,并在后期随着肝组织炎症及纤维化减轻,表达逐渐减少。 4肝组织IGF-1 mRNA的表达 RT-PCR检测显示模型组各时间段肝组织IGF-1 mRNA表达均较对照组明显增加,第8周IGF-1 mRNA表达为最高,以后随着CCL4应用的停止和肝纤维化的好转,IGF-1 mRNA表达逐渐减少。 5肝组织Hyp检测 模型组随着CCL4的应用,肝组织Hyp含量逐渐增加,到第8周达到高峰,以后随着CCL4的停用和肝纤维化的逆转,Hyp含量逐渐降低。模型组各时间点肝组织Hyp含量均高于对照组。 6肝组织Hyp含量与肝组织α-SMA和IGF-1蛋白表达的相关关系 IGF-1和α-SMA蛋白表达与肝组织Hyp含量间存在直线相关关系,相关系数分别为0.953和0.944(P<0.01)。 第二部分:扶正化瘀方对实验性肝纤维化及肝组织IGF-1的影响 1血清学指标 模型组及扶正化瘀干预组大鼠血清ALT、AST在第4、6、8周时较对照组明显升高,干预组大鼠血清ALT、AST在相应时间段均显著低于模型组。 2肝组织病理学变化 HE及Masson染色:对照组大鼠肝组织中肝小叶结构正常,肝细胞条索排列整齐,在血管壁和汇管区可见少量纤维结缔组织;模型组大鼠的肝小叶结构被破坏,可见肝细胞变性、坏死,大量的炎细胞浸润,随纤维化进展,大量纤维组织增生逐渐增多,假小叶形成;干预组大鼠肝组织与同时间段模型组相比炎症及纤维化程度均有明显减轻。 3肝组织α-SMA和IGF-1蛋白表达 3.1肝组织α-SMA蛋白表达:免疫组织化学染色显示对照组α-SMA仅在血管壁上有表达;随造模时间延长,模型组α-SMA表达逐渐增强,在血管壁、汇管区及纤维间隔均有阳性表达。干预组α-SMA较模型组同时间段的表达均显著降低。 3.2肝组织IGF-1蛋白表达:免疫组织化学染色显示对照组大鼠肝细胞浆表达少量IGF-1蛋白;模型组IGF-1表达较对照组增加;干预组与同时期模型组IGF-1表达相比均明显减少。 4肝组织IGF-1 mRNA的表达 RT-PCR检测显示模型组与干预组肝组织IGF-1 mRNA表达均较对照组明显增加,趋势与IGF-1蛋白表达一致;干预组IGF-1 mRNA在各时间段表达均明显低于模型组。 5肝组织Hyp检测 模型组与干预组Hyp含量与对照组相比均显著增加,干预组Hyp含量在各时间段表达均明显低于模型组。 结论: 1大鼠经CCL4腹腔注射8周,可诱导典型的肝纤维化自发逆转模型,其病理特征符合人类肝纤维化特点。 2 IGF-1与肝组织纤维化程度及炎症坏死程度密切相关,可能具有促进肝纤维化的作用。 3 IGF-1与肝组织α-SMA蛋白的表达趋势一致,并且IGF-1、α-SMA的蛋白表达均与Hyp含量呈直线相关关系,IGF-1可能通过促进HSC的活化及增殖,促进肝纤维化的形成。 4扶正化瘀方能够明显抑制肝脏炎症及纤维化,改善肝功能。 5扶正化瘀方可能通过抑制IGF-1、α-SMA的蛋白表达,减少肝组织Hyp含量,抑制HSC的活化、增殖,从而发挥抗肝纤维化作用。


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